[发明专利]转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法

摘要

一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量的方法，该方法包括金鱼草Rosea1基因和Delila基因的克隆、构建含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体、制备含有金鱼草Rosea1基因和Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株4个步骤。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参中金鱼草Rosea1基因和Delila基因的表达；对转基因丹参中迷迭香酸和丹酚酸含量同时进行高效液相色谱测定，筛选得到迷迭香酸和丹酚酸B含量同时提高的转基因丹参植株。采用本发明获得的转基因丹参植株，生长45天的干燥根中，迷迭香酸的含量为26.96±0.90mg/g，丹酚酸B的含量达63.64±1.94mg/g，分别是同时期非转化普通丹参中迷迭香酸和丹酚酸B的1.60倍和2.12倍。

主权项

一种转基因同时提高丹参中迷迭香酸和丹酚酸B含量的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：（1）金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的克隆提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，采用Primer Premier 5.0软件，设计金鱼草Delila和Rosea1基因编码框的上游引物、下游引物，并在金鱼草Delila基因的上游引物前引入BamH I限制性酶切位点和保护碱基GAGGATCC，在下游引物前引入Sac I限制性酶切位点和保护碱基CAGGAGCTC，金鱼草Delila  基因上游引物序列为Delila‑F：5’‑GAGGATCCATGGCTACTGGTATCCAAAACCAAAAG‑3’，下游引物序列为Delila‑R：5’‑CAGGAGCTCAACTTCAAGACTTCATAGTAACTTTCTG‑3’；在金鱼草Rosea1基因的上游引物前引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GA AGATCT，在下游引物前引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTAACC，金鱼草Rosea1基因的上游引物为Rosea1‑F：5’‑GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT‑3’，下游引物为Rosea1‑R：5’‑CAGGGTAACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT‑3’；以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应分别扩增金鱼草Delila基因和Rosea1基因，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19‑T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a，连接产物与大肠杆菌DH5a的体积比为1：10，连接产物转入100μL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列，序列如下：金鱼草Rosea1基因：atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa                                         663金鱼草Delila基因：atggctactg gtatccaaaa ccaaaagata gtgcctgaga atttgaggaa  50gcaacttgct attgctgtga gaagtatcca atggagttat gcaattttct  100ggtccaattc agttgcacaa ccaggggtct tggagtgggg tgatgggttc  150tacaatggag atattaaaac tcgaaaaact gtacaatctg tcgaattgaa  200tcaagatcag ctgggattgc agagaagtga tcaattgaga gaactttatg  250agtctctttc acttggtgaa accaacacac aagctaaaag gcctactgct  300gcattatcac cagaagacct cactgatgct gagtggtttt tcttggtttg  350catgtctttc atattcaata ttggccaagg gttgcctgga agaacattag  400cacgaaatca agcagtatgg ctatgcaacg ctcatcgtgc ggacaccaaa  450gttttctcgc gttctttgct tgcaaagagt gcgtcaattc agacagttgt  500gtgctttcca tattcagaag gtgtagttga gctgggagca acagagctag  550taccggagga tttgaatcta atccagcata taaaaacttc attcttggac  600agtcctgcca ccgttcccaa gattcccaac tatgtctcca acagtattac  650aaacaacaat gacctcattt gtgaagcgct tgaacatgct aatataccag  700aaaacgatct tgatcagctt ttgaattgtc cagacacgaa catatgttct  750cctgataaca gtttggatga ctttgcagac aatttactca tagacgaatc  800gaatttggca gaaggcatca atggggaggt tcctcaaaca caaagctggc  850ctttcatgga tgatgcaatc agcaattgtc tcaatagttc tatgaattct  900agtgactgta tatctcaaac tcatgaaaat ctagagtctt ttgctccact  950ttctgatgga aaagggccac cggagacgaa taattgtatg cacagcactc  1000aaaaatgcaa tcagcagata gaaaacacgg gtgtccaagg cgatgaggtc  1050cattatcaag gggtactttc caatcttttg aagagttccc atcagttggt  1100tcttggtccc tacttcagaa atgggaatag agaatcaagc ttcgttagtt  1150ggaacaagga tggatcgtcg ggtactcatg ttccccgaag cggaacctca  1200caaagatttc tgaagaaagt actttttgaa gtagctagaa tgcatgaaaa  1250ctccaggctt gatgctggta aacaaaaggg caacagtgac tgccttgcaa  1300agccaacggc tgatgaaatt gatagaaacc acgtcttgtc agagagaaaa  1350cgcagagaga aaataaacga acggtttatg attcttgcat ccctagtccc  1400atccggtggc aaggttgaca aagtatcaat actagaccat acaatagatt  1450acttgagagg gcttgagagg aaagtcgacg agctggaatc taacaaaatg  1500gtaaagggcc gggggcggga atcaactaca aaaactaaac tacacgatgc  1550cattgagagg acctctgata attatggcgc aacaaggaca agtaacgtca  1600agaaaccgtt gacaaacaag agaaaggctt ctgatacgga caagattgga  1650gccgtaaata gcagaggtcg attgaaagat tccttaacag ataatataac  1700tgtgaacatt acaaacaagg atgtgttgat tgtcgtgact tgttcttcca  1750aggagtttgt attgcttgaa gtgatggaag ccgtaagacg actaagtttg  1800gattccgaaa ctgttcaatc ttccaacaga gatggaatga tatctattac  1850cataaaagcc aagtgcaagg gattgaaggt tgcatcagca agtgtgatca  1900aacaagctct tcagaaagtt actatgaagt cttgaagtt              1939（2）构建含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体用EcoR I和HindIII双酶切植物表达载体pBI121和pCAMBIA‑1302，回收的酶切产物利用 T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测及提取质粒做酶切检测筛选阳性克隆，获得pCAMBIA‑1302+中间载体；用BamH I和Sac I双酶切含有金鱼草Delila基因的pMD19‑T Simple载体和pCAMBIA1302+中间载体，回收的酶切产物用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证获得pCAMBIA1302+‑DEL重组质粒；用BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD 19‑T Simple载体和pCAMBIA1302+‑DEL重组质粒，回收的酶切产物利用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，经菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切验证，得到含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体，该表达载体序列如核苷酸列表<210>3所示；（3）制备含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株将含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；（4）制备转基因丹参植株采用常规组织培养技术方法获得无菌丹参试管苗，根癌农杆菌介导的丹参遗传转化体系采用叶盘法，即将继代培养15天的丹参无菌苗叶片切成小块，转入每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6‑苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a‑萘乙酸的MS培养基上预培养1天，用含有金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株浸染预培养过的丹参叶片，浸染方法为28℃恒温100转/分钟浸染25～30分钟，将浸染过的叶片置于每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6‑苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a‑萘乙酸的MS培养基上暗培养2～3天至叶片边缘有农杆菌长出，将叶片从培养基上取出，转接到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的MS培养基中进行培养，长出抗性芽后将其转入到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用金鱼草Rosea1基因和金鱼草Delila基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株的DNA，波长为302nm的紫外线下可同时观察到663bp和1939bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。