[发明专利]胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途

摘要

本发明涉及胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括：（1）胃肠肿瘤发病相关的9种抑癌基因启动子区CpG岛扩增与测序引物25对；（2）PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可以通过甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP)、亚硫酸氢盐修饰和限制性内切酶联合分析（combined bisulphite-restriction analysis,COBRA）、或亚硫酸氢盐修饰后测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）等方法分析基因CpG岛甲基化状态。本试剂盒具有高效的CpG岛甲基化检出作用。用于胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测。

主权项

一种胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：（1）抑癌基因启动子区CpG岛扩增与测序引物25对；（2）PCR扩增用试剂；所述的25对引物序列如下：第1对：MLH1基因MSP分析引物MLH1‑M，用于扩增MLH1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑ATTGGTTGGATATTTCGTATTTTTC‑3'  R: 5'‑CCTAAAACGACTACTACCCGCT‑3'    第2对：MLH1基因MSP分析引物MLH1‑U，用于扩增MLH1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑ATTGGTTGGATATTTTGTATTTTTTG‑3'R: 5'‑CTCCCTAAAACAACTACTACCCACT‑3' 第3对：MLH1基因BSP分析引物MLH1‑BSP，用于扩增MLH1基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑GGTATTTTTGTTTTTATTGGTTGGATAT‑3'R: 5'‑CAACTTAAATACCAATCAAATTTCTCA‑3' 第4对：MSH2基因MSP分析引物MSH2‑M，用于扩增MSH2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑CGGAGAAGTCGATTATTATAGTGC‑3'  R: 5'‑CTAAATCTTAAACACCTCCCGAA‑3'    第5对：MSH2基因MSP分析引物MSH2‑U，用于扩增MSH2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F:5'‑TGGAGAAGTTGATTATTATAGTGTGT‑3'R: 5'‑CCTAAATCTTAAACACCTCCCAAA‑3' 第6对：MSH2基因BSP分析引物MSH2‑BSP，用于扩增MSH2基因启动子区CpG岛并测序鉴定F:5'‑GTTTTGGAAGTTGATTGGGTGTGGT‑3'  R: 5'‑CCTAAATCTTAAACACCTCCC‑3' 第7对：PHD3基因COBRA或BSP分析引物PHD3‑BSP，用于扩增PHD3基因启动子区CpG岛并酶切鉴定或测序鉴定F: 5'‑ Ggtagtggtggtttttta‑3'   R: 5'‑ CATAATATATCCCAAAAACATCTC‑3' 第8对：Klotho基因MSP分析引物Klotho ‑M，用于扩增Klotho基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑ATGAATTTGAGCGTTTACGAAAC‑3'  R: 5'‑ACTCCGCTAACAATAATTACCTACG‑3'    第9对：Klotho基因MSP分析引物Klotho ‑U，用于扩增Klotho基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑ATGAATTTGAGTGTTTATGAAATGT‑3'R: 5'‑TCCACTAACAATAATTACCTACAAA‑3' 第10对：Klotho基因BSP分析引物Klotho ‑BSP，用于扩增Klotho基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑GTTTTTTTTAGGGTATTTTT‑3'   R:5'‑CCCAATAATACAAAATAACCAC‑3' 第11对：IGFBP7基因MSP分析引物IGFBP7‑M，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑AAATTAGAGGGTGGAAGAGTCGT‑3' R: 5'‑CTACTAACGTCGAAAAATAAACGAA‑3'    第12对：IGFBP7基因MSP分析引物IGFBP7‑U，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑AGAAATTAGAGGGTGGAAGAGTTGT‑3'R: 5'‑CTACTAACATCAAAAAATAAACAAA‑3' 第13对：IGFBP7基因BSP分析引物IGFBP7 ‑BSP，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑GGGGAGAAGGTTATTATTTAGGTTAGTAA‑3'R:5'‑CCCTCCCATCTAACTCCTAAAATAC‑3' 第14对：SFRP1基因MSP分析引物SFRP1‑M，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑GTATTATTTGAGGTTAGGAGTTCGA‑3'R: 5'‑CTAAAATACAATAACGCTATCTCCG‑3'    第15对：SFRP1基因MSP分析引物SFRP1‑U，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑GTATTATTTGAGGTTAGGAGTTTGA‑3'R: 5'‑AAAATACAATAACACTATCTCCACT‑3' 第16对：SFRP1基因BSP分析引物SFRP1 ‑BSP，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑TTAGTTTGGTTAATATGGTGAAATTT‑3'R: 5'‑ACAAACCCATAAAATTATAAAAACTTTTT‑3' 第17对：SFRP2基因MSP分析引物SFRP2‑M，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑CGGATTGGGGTAAAATAAGTTC‑3'  R: 5'‑AACTACGAAAATAAAAAACACGCA‑3'    第18对：SFRP2基因MSP分析引物SFRP2‑U，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑TTTGGATTGGGGTAAAATAAGTTT‑3' R: 5'‑AACTACAAAAATAAAAAACACACA‑3' 第19对：SFRP2基因BSP分析引物SFRP2 ‑BSP，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑ATGTTTGGTAATTTAGTAGAAATTT‑3'  R: 5'‑ACAACAAACAAAAAAACCTAACC‑3' 第20对：SFRP5基因MSP分析引物SFRP5‑M，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑TAGGGAGTTTTGGGGAGAAAC‑3'  R: 5'‑AAAACGAAAAAACAATAAAAACGAC‑3'    第21对：SFRP5基因MSP分析引物SFRP5‑U，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑GTAGGGAGTTTTGGGGAGAAAT‑3' R: 5'‑AAAACAAAAAAACAATAAAAACAAC‑3' 第22对：SFRP5基因BSP分析引物SFRP5 ‑BSP，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑ATGGGGTTTGGTATTAAGTTTAATG‑3' R: 5'‑ ACTCCCTACCTCCCTAAACATTTT‑3' 第23对：P16基因MSP分析引物P16‑M，用于扩增P16基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段F: 5'‑ GGGGAGTAGTATGGAGTTTTCG‑3'  R: 5’‑AACTATTCGATACGTTAAACAACGC‑3’    第24对：P16基因MSP分析引物P16‑U，用于扩增P16基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段F: 5'‑GGGAGTAGTATGGAGTTTTTGG‑3'  R:5'‑ACTATTCAATACATTAAACAACACC‑3' 第25对：P16基因BSP分析引物P16‑BSP，用于扩增P16基因启动子区CpG岛并测序鉴定F: 5'‑TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG‑3'  R:5'‑CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA‑3'。