[发明专利]一种高正变率菌种选育方法

摘要

本发明公开了一种消除中间产物代谢积累的高效菌种选育方法，步骤为：(1)LC/MS（液相/质谱联用）分析检测出发菌株的代谢产物，找到积累最多的途径中间产物，确定代谢途径中关键步骤的代谢抑制点；（2）通过色谱制备柱分离菌株的培养物，提取积累最多的途径中间产物；（3）对步骤（2）获得的途径中间产物，筛选其抗性/忍耐突变株，通过消除代谢途径中关键步骤的代谢抑制，消除中间产物的积累，更多地流向目的产物，从而筛选到高产菌株。本发明公开的菌种选育方法，从复杂的生物合成途径中找到关键步骤，消除其中间产物的代谢抑制和积累，从而提高菌株的合成能力，大大提高了筛选效率，具有方向性强、高正变率、提高幅度大、方法简单等优点，适合于所有微生物的选育，尤其适合于生物合成途径复杂的次级代谢产物的菌种选育。

主权项

一种高正变率菌种选育方法，其特征在于包括如下步骤：（1）代谢产物的检测分析：出发菌株经发酵培养，培养物经分离去除营养物质，然后通过LC/MS检测分析，找出积累量最多的途径中间产物，并进行初步结构分析和确证；（2）途径中间产物的分离制备：通过色谱制备柱分离菌株的代谢产物，制备积累量最多的途径中间产物；（3）确定最低抑菌浓度：考查确定步骤（2）中制备得到的途径中间产物对于所述出发菌株的最低抑菌浓度；（4）筛选：将出发菌株用诱变剂进行诱变处理后，涂布于含有最低抑菌浓度途径中间产物的选择性平板，适宜温度下培养1‑15天，挑选上述选择性平板上生长的菌落，接种于固体斜面培养基，上述适宜温度下培养至菌落成熟，转接至摇瓶发酵培养基，上述适宜温度下摇瓶培养至发酵终点，测定产物含量，发酵水平最高的菌株，进行保藏备用；所述适宜温度和所述培养基根据出发菌株确定。