[发明专利]一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法

摘要

本发明涉及一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法。收集腔前颗粒细胞放入生长液滴中，在培养箱中过夜培养，做成颗粒细胞层；将收集的55～65μm之间的卵母细胞放入颗粒细胞层上，在培养基中添加浓度为100ng/ml的ActA共培养，实现未成熟卵母细胞的体外成熟。裸卵与颗粒细胞共培养条件下，ActA可以促进卵母细胞进入减数分裂，提高卵母细胞的成熟数量。在培养到3～4天时，卵母细胞的凋亡发生比例为14.3±1.7％；共培养7天后，裸卵的直径变化为61.79±3.2～67.27±3.52μm；卵母细胞胞质GSH表达量为11.33±1.38(μM)。该方法操作简单，建立了小卵泡的体外发生和发育体系，有利于开发卵母细胞资源并用于生物和医学研究。

主权项

一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步、腔前颗粒细胞的收集和培养：用出生后12～14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及颗粒细胞，收集颗粒细胞放入备好的生长液滴中培养24小时，培养条件是每个液滴100μl，37℃，5％CO2、饱和湿度的培养箱里，制成颗粒细胞层；第二步、12～14dpp卵母细胞的收集和培养：机械法分离出生后12～14天小鼠卵巢后，体视镜下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母细胞，然后挑出直径在55～65μm之间的卵母细胞，在生长培养液中培养，培养条件是37℃，5％CO2、饱和湿度的培养箱里，每隔2天换半液；以每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上培养，在培养基中添加浓度为100ng/ml的ActA；第三步、卵母细胞的成熟培养：卵母细胞培养7天后，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前备好的培养液滴中，6cm培养皿，每个液滴100μl，37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例；其中，第一步中生长液的配制：密理博高糖培养基；牛血清白蛋白3mg/ml；脂肪酸1mg/ml；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml；表皮生长因子5ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素；第二步中卵母细胞生长培养液的配制：密理博高糖培养基；10％胎牛血清；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10mIU/ml；表皮生长因子5ng/ml；ActA 100ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素；第三步中成熟培养液的配制：密理博高糖培养基；牛血清白蛋白3mg/ml；脂肪酸1mg/ml；1％胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素100mIU/ml；表皮生长因子1ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素。