[发明专利]一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种ActA(Activin A，激活素A)促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，特别是涉及一种在体外培养卵母细胞时，在培养基中加入ActA，促进未成熟卵母细胞成熟的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。 

背景技术：

哺乳动物卵巢中含有各个不同发育阶段的大量卵泡。最大的一部分是原始卵泡。然而，雌性具有繁殖力的时期，只有一小部分卵泡生产出具有排卵能力并成熟的卵母细胞。剩余的卵巢卵泡(＞99.9％)最后闭锁。为了获得额外的雌性配子资源，致力于发展在卵泡早期发育阶段生产完全生长的具有发育能力的卵母细胞技术具有很大的意义。早期卵泡的体外发育研究对调节原始卵泡到初级卵泡的转变机制的研究是很重要的并具有临床意义，并且可以应用于辅助生殖技术体外培养原始卵泡来生产成熟卵母细胞，用以生产有价值的家畜和濒危灭绝的野生品种。 

卵泡体外培养技术的建立可应用于生物学和医学等领域，可以用来弥补卵母细胞在保存过程中由于损伤导致的受精能力的丧失缺憾(环境因素、放疗、化疗)；为患癌症的年轻女性在癌症治疗时保存她们的生育能力带来新的希望；并为治疗性克隆和卵巢不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法通过在卵母细胞和颗粒细胞的共培养时，在培养基中加入ActA来促进未成熟卵母细胞的体外成熟，为开发卵母细胞资源应用于生物医学提供了很好的技术手段。 

为了实现上述发明目的，本发明的一种ActA促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法，收集腔前颗粒细胞放入提前备好的生长液滴中，在培养箱中过夜培养，做成颗粒细胞层；将收集的55～65μm之间的卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上，在培养基中添加浓度为100ng/ml的ActA共培养，实现未成熟卵母细胞的体外成熟。 

本发明方法包括下列具体操作步骤： 

第一步、腔前颗粒细胞的收集和培养： 

用出生后12～14天的小鼠，取出卵巢后，用消化酶消化成裸卵及颗粒细胞，收集颗粒细胞放入备好的生长液滴中培养24小时，培养条件是每个液滴100μl，37℃，5％CO₂、饱 和湿度的培养箱里，制成颗粒细胞层； 

所述消化酶是含有0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV和0.02％DNAse-I(DNA消化酶I，购自sigma公司)的消化酶。 

所述生长液的配制：α-MEM(密理博高糖培养基，HyClone公司)；BSA(牛血清白蛋白，Roche公司)3mg/ml；脂肪酸(Fetuin)1mg/ml；1％ITS-mix(胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物，HyClone公司)；FSH(促卵泡素，HyClone公司)10mIU/ml；EGF(表皮生长因子，HyClone公司)5ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素。 

第二步、12～14dpp卵母细胞的收集和培养： 

机械法分离出生后12～14天小鼠卵巢后，体视镜下刺碎并用消化酶消化，口吸管取出卵母细胞，然后挑出直径在55～65μm之间的卵母细胞，在生长培养液中培养，培养条件是37℃，5％CO₂、饱和湿度的培养箱里，每隔2天换半液；以每个液滴20个卵母细胞放入培养24h后的颗粒细胞层上培养，在培养基中添加浓度为100ng/ml的ActA； 

所述消化酶是含有0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV和0.02％DNAse-I的消化酶。 

卵母细胞生长培养液的配制：α-MEM；10％FCS(胎牛血清)；1％ITS-mix；FSH 10mIU/ml；EGF 5ng/ml；ActA 100ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素。 

第三步、卵母细胞的成熟培养： 

卵母细胞培养7天后，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前备好的培养液滴中(6cm培养皿，每个液滴100μl，37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱里培养过夜)，在37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱里培养18h，统计卵母细胞成熟的比例。 

成熟培养液的配制：α-MEM；BSA 3mg/ml；Fetuin 1mg/ml；1％ITS-mix；FSH 100mIU/ml；EGF 1ng/ml；1％丙酮酸钠；1％青霉素和链霉素。