[发明专利]海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法

摘要

本发明涉及一种海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法，具体是利用一种海洋浮游植物米氏凯伦藻与单细胞凝胶电泳技术，来检测海水中的有机污染物。本发明将海洋浮游植物米氏凯伦藻作为海水中有机污染物遗传毒性检测的生物材料，米氏凯伦藻无细胞壁，具有一个大而明显的细胞核，对水体中理化因素的变化极其敏感，是在群体水平上进行海水中有机污染物潜在遗传毒性研究与评价的良好生物材料。本发明的方法既可以将海水中有机污染物提取出来检测其遗传毒性，也可以直接用于排污口、养殖区等污染严重的海区海水总遗传毒性的检测。检测海水总遗传毒性时只需将海水过滤除去泥沙和杂质即可用进行后续的检测。

主权项

一种海水中有机污染物潜在遗传毒性的检测方法，其特征在于包括以下的步骤：1)海水中有机污染物的提取与浓缩：将海水样品用液‑液萃取法和固相萃取法提取海水中的有机污染物，并经无水Na2SO4干燥柱干燥，二氯甲烷淋洗得到洗脱液，将洗脱液用氮气吹干，最后用二甲亚砜溶解，得到有机物浓缩液备用；2)米氏凯伦藻的细胞收集和浓缩；选取处于指数生长期的米氏凯伦藻，用5μM的筛绢通过自然沉降法来浓缩和富集；收集完之后用过滤消毒的无菌大洋水将米氏凯伦藻细胞洗下来，调整米氏凯伦藻细胞密度在1×105cells/mL左右，备用；3)细胞染毒处理：将步骤2)中获得的细胞与步骤1)的有机物浓缩液在20℃条件下进行染毒处理1h，染毒体系总体积为5mL；染毒体系中有机物浓度分别设为原海水中有机污染物浓度的1倍，5倍，10倍，100倍4个浓度梯度，将未染毒的米氏凯伦藻细胞作为对照组；染毒结束后，以2000转/分钟的速度离心去除上清得到米氏凯伦藻细胞，将实验组和对照组的米氏凯伦藻细胞重新用无菌大洋水悬浮，调整米氏凯伦藻细胞浓度在1×105cells/mL左右，备用；4)制备第一层胶：配制0.8％的正常熔点的琼脂糖凝胶NMA，在80℃条件下，从磨砂载玻片的一端垂直流下，铺满整个载玻片，再将铺过胶的载片在80℃烤干，晾凉，备用；5)制备第二层胶：将配好的0.6％低熔点琼脂糖凝胶LMA，于水浴37℃保温，取步骤3)中处理后的各实验组和对照组中的米氏凯伦藻细胞25uL，与75uL低熔点的琼脂糖凝胶LMA混匀后，取60uL加到铺有第一层胶的载玻片上，盖上盖玻片，4℃黑暗下固化10‑30min；6)细胞裂解：移去第二层胶上的盖玻片，将铺有第一层胶和第二层胶的载玻片完全浸入4℃预冷的新鲜配制的裂解液中，4℃黑暗下裂解2h；7)DNA解旋：将裂解结束后的载玻片用磷酸缓冲液溶液轻轻漂洗3次后，置于水平电泳槽的正极端，倒入新鲜配制的电泳液，使电泳液没过载玻片约2‑3mm，室温下避光解旋30min；8)细胞电泳：DNA解旋结束后，在电压25V，电流300mA的条件下，电泳20‑30min；9)中和：电泳结束后将载玻片置于0.4mmol/L、pH＝7.4的Tris‑HCl缓冲液中，中和漂洗3次，每次5分钟；10)染色：向第二层胶上滴加50ug/L的碘化丙啶，避光染色5min；11)显微照相、图像分析和数据处理：染色结束后用PBS溶液洗去多余的染料，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察拍照；图片分析处理采用CASP软件，主要考察参数为彗星尾距、0live尾距和尾长，每张载玻片分析50‑100个细胞；数据分析采用SPSS13.0软件进行ANOVA分析，将实验组与对照组进行t‑检验，P＜0.05作为海水有机污染物潜在遗传毒性大小的显著性依据。