[发明专利]壳聚糖－精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法

摘要

一种壳聚糖－精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，涉及壳聚糖衍生物固定化酶的方法。本发明以市售壳聚糖为原料，先制备交联壳聚糖树脂。再制备壳聚糖－精氨酸阴离子树脂，最后进行希夫反应固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。本发明具有方法简单，操作简便，反应条件温和，生产成本低，固定化酶的稳定性高，酶活回收率高达89.95％，半衰期长，即75℃的半衰期长达18小时，4℃的半衰期长达56天，最适pH值仅为5.92。采用本发明制备出的产品，可广泛应用于医药、食品、轻工业等行业的各种水相及非水相的酶促反应。

主权项

1.一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于具体的方法步骤如下：(1)制备交联壳聚糖树脂以市售壳聚糖为原料，先将壳聚糖加入盐酸质量百分数为1～5％稀盐酸中，就制备出壳聚糖质量百分数为1～4％的壳聚糖酸性溶胶，后按壳聚糖酸性溶胶∶液体石蜡的体积比为1∶1～4的比例，将壳聚糖酸性溶胶缓慢加入液体石蜡中，搅拌20～30min，并加热升温至35～45℃制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.25％的吐温80，进行乳化20～30min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.3％戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.01～0.1％碳酸钙致孔剂，进行制孔反应50～70min制得壳聚糖微球的悬浮液，最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9～10，并加热至55～75℃，搅拌固化2～4h，再过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用质量分数为1～5％稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性；(2)壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备第(1)步完成后，将第(1)步制备出的交联壳聚糖树脂，加入精氨酸质量分数为0.5～2.0％精氨酸溶液中，振荡20～30min，制备出壳聚糖质量分数为0.5～2.5％的壳聚糖-精氨酸溶液，然后按壳聚糖-精氨酸溶液中精氨酸∶二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶0.5～2.5的比例，在壳聚糖-精氨酸溶液中，加入DCC接肽缩合剂，进行缩合反应20～40min，最后经过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用蒸馏水透析8～12h后，再过滤，再弃滤液，再收集滤渣；(3)胰凝乳蛋白酶的固定第(2)步完成后，先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为4.5～6.0磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，就制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.05～0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液，后按第(2)步制备出的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂∶胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1∶15～25的比例，将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，在30～60℃的恒温水浴条件下，振荡20～40min，再按戊二醛∶壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的质量比为1∶6～14的比例，将戊二醛加入到悬浮壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，并置于振荡器中振荡，进行希夫反应50～70min后，进行抽滤，弃滤液，收集树脂滤渣，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤4～7次，再抽滤，再弃滤液，再收集壳聚糖-精氨酸阴离子固定化胰凝乳蛋白酶滤渣。