[发明专利]壳聚糖－精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶固定化技术领域，特别涉及壳聚糖衍生物固定化酶的方法。

技术背景

研究表明：胰凝乳蛋白酶在医药上具有消化脓汁和坏死组织，消净创面，局部消炎，促进血肿吸收，创面愈合等功效；在食品、轻工等行业具有分解蛋白质、皮革脱毛等功能。目前，使用的游离酶，主要有成本高，利用率低，排放的废酶还污染环境等缺点。因此，研制使用半衰期较长的新型固定化胰凝乳蛋白酶，具有重要的经济、社会价值。

壳聚糖是自然界含量丰富、价廉易得的天然高分子材料，因其具有良好的成膜、保湿、吸附、抗菌等特性，广泛用于医药、食品、轻工等行业中。又因壳聚糖具有易生物降解，安全无毒，生物相容性好，容易进行化学修饰，特别是壳聚糖衍生物具有亲水性好、刚性大、机械性良好等特点，是优异的固定化酶的载体。

现有固定化酶的方法包括包埋法、吸附法、共价结合法及交联法等。包埋法是指将酶包埋在高分子凝胶细微网格或半透膜中，其制备工艺简便且反应条件较为温和，可获得较高的酶活力回收，由于只有小分子可通过高分子凝胶网格，且扩散阻力会导致酶活力降低，因此包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶。吸附法则是指酶被吸附于不溶性载体的固定化方法，该法操作简便，条件温和，酶的活力损失很少，载体价廉易得，可反复使用，但是，酶与载体的相互作用力弱，易脱落。共价结合法是指酶与载体以共价键结合的固定化方法，该法固定化的酶，不易脱落，可连续使用相当长的时间，但载体的活化比较复杂，且结合法有较激烈的反应而使酶活力损失较大。交联法指用双功能或多功能试剂使酶与载体之间交联的固定化方法，交联法固定化酶稳定性好，如宁波大学学报1999年3月第1期的“壳聚糖固定化胰蛋白酶的制备及理化性质研究”一文，公开了从甲克质粗品中获得的壳聚糖，再在交联剂戊二醛的作用下将胰蛋白酶固定到该壳聚糖上的方法；该法的不足之处在于从甲克质粗品中难以获得纯净的壳聚糖，而且直接以壳聚糖作为载体，胰蛋白酶大分子靠近时位阻大，直接交联固定化酶效率低，容易引起胰蛋白酶分子自交联。又如公开号CN1904043A的“一种纳米磁性壳聚糖固定化酶的制备方法”专利，公开了使用表面含有酰氯基团的纳米磁性壳聚糖与酶蛋白分子在磁场作用下反应制备固定化酶的方法；该法的不足之处在于制备一定粒径的纳米磁性壳聚糖载体比较困难，同时纳米磁性壳聚糖在使用过程中容易被氧化而发生沉聚，导致酶活力的降低。

发明内容

本发明的目的是针对现有壳聚糖树脂固定化酶方法的不足之处，提供一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法。该方法具有操作简单、酶活回收率高、反应条件温和、制备成本低等特点，同时固定化胰凝乳蛋白酶较游离胰凝乳蛋白酶酶热稳定性增加，适用pH值降低，半衰期延长，而且可反复利用，减少污染，充分利用资源。

本发明的机理：由于壳聚糖分子链中含有大量的游离氨基，这些氨基有一孤对电子，具有很强的亲核性，而戊二醛是一种常用的双官能团试剂，可与壳聚糖的氨基发生交联反应生成席夫碱结构，交联主要是在分子间发生；二环己基碳二亚胺(DCC)是一种常用的接肽缩合剂，它可以活化羧基，即加强羧基碳原子的亲电性，使得亲核的非离子化氨基很容易对它进行攻击，从而发生缩合反应生成肽键。再次以戊二醛作为交联剂，使胰凝乳蛋白酶表面游离氨基与精氨酸残余氨基发生shiff反应，即得壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶。

本发明的目的是这样实现的：一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，以市售壳聚糖为原料，先制备交联壳聚糖微球，再制备壳聚糖-精氨酸阴离子树脂，最后进行希夫反应固定化胰凝乳蛋白酶而得成品。具体的方法步骤如下：

(1)制备交联壳聚糖树脂