[发明专利]壳聚糖－精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于具体的方法步骤如下：

(1)制备交联壳聚糖树脂

以市售壳聚糖为原料，先将壳聚糖加入盐酸质量百分数为1～5％稀盐酸中，就制备出壳聚糖质量百分数为1～4％的壳聚糖酸性溶胶，后按壳聚糖酸性溶胶∶液体石蜡的体积比为1∶1～4的比例，将壳聚糖酸性溶胶缓慢加入液体石蜡中，搅拌20～30min，并加热升温至35～45℃制得到壳聚糖石蜡溶液后，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.25％的吐温80，进行乳化20～30min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.05～0.3％戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.01～0.1％碳酸钙致孔剂，进行制孔反应50～70min制得壳聚糖微球的悬浮液，最后用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9～10，并加热至55～75℃，搅拌固化2～4h，再过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用质量分数为1～5％稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙，再用蒸馏水洗涤至中性；

(2)壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备

第(1)步完成后，将第(1)步制备出的交联壳聚糖树脂，加入精氨酸质量分数为0.5～2.0％精氨酸溶液中，振荡20～30min，制备出壳聚糖质量分数为0.5～2.5％的壳聚糖-精氨酸溶液，然后按壳聚糖-精氨酸溶液中精氨酸∶二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶0.5～2.5的比例，在壳聚糖-精氨酸溶液中，加入DCC接肽缩合剂，进行缩合反应20～40min，最后经过滤，弃滤液，收集滤渣，对滤渣先用乙醇洗涤3～6次，后用蒸馏水透析8～12h后，再过滤，再弃滤液，再收集滤渣；

(3)胰凝乳蛋白酶的固定

第(2)步完成后，先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为4.5～6.0磷酸盐缓冲液中，搅拌均匀，就制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.05～0.08mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液，后按第(2)步制备出的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂∶胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1∶15～25的比例，将壳聚糖-精氨酸阴离子树脂加入胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，在30～60℃的恒温水浴条件下，振荡20～40min，再按戊二醛∶壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的质量比为1∶6～14的比例，将戊二醛加入到悬浮壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中，并置于振荡器中振荡，进行希夫反应50～70min后，进行抽滤，弃滤液，收集树脂滤渣，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤4～7次，再抽滤，再弃滤液，再收集壳聚糖-精氨酸阴离子固定化胰凝乳蛋白酶滤渣。

2.按照权利要求1所述的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂固定化胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于具体的方法步骤如下：

(1)制备交联壳聚糖树脂

同权利要求1，特征是：将壳聚糖加入盐酸质量百分数为2％稀盐酸中，制备出壳聚糖质量百分数为2％的壳聚糖酸性溶胶，壳聚糖酸性溶胶∶液体石蜡的体积比为1∶1，搅拌25min，并加热升温至40℃，再加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.1％的吐温80，进行乳化25min，然后加入占壳聚糖石蜡溶液体积分数为0.15％戊二醛交联剂，再加入占壳聚糖石蜡溶液质量分数为0.05％碳酸钙致孔剂，进行制孔反应60min，用氢氧化钠溶液调节壳聚糖微球悬浮液的pH值为9.5，并加热至60℃，搅拌固化3h，对滤渣先用乙醇洗涤5次，后用质量分数为3％稀盐酸溶解滤渣中的碳酸钙；

(2)壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的制备

同权利要求1，特征是：精氨酸溶液中精氨酸质量分数为1％，振荡25min，制备出壳聚糖质量分数为1.5％的壳聚糖-精氨酸溶液，壳聚糖-精氨酸溶液中精氨酸∶二环己基碳二亚胺的摩尔比为1∶1，进行缩合反应30min，对滤渣先用乙醇洗涤4次，后用蒸馏水透析10h；

(3)胰凝乳蛋白酶的固定

同权利要求1，特征是：先将胰凝乳蛋白酶加入pH值为5.9磷酸盐缓冲液中，制备出胰凝乳蛋白酶的摩尔浓度为0.06mol/L的胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液，第(2)步制备出的壳聚糖-精氨酸阴离子树脂∶胰凝乳蛋白酶磷酸盐溶液中胰凝乳蛋白酶的质量比为1∶20，在45℃的恒温水浴条件下，振荡30min，戊二醛∶壳聚糖-精氨酸阴离子树脂的质量比为1∶8，进行希夫反应60min后，对树脂滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤6次。