[发明专利]采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法，利用UDG能切断分子信标中的尿嘧啶(U)碱基与糖基之间的N－糖苷键，再用碱处理缺碱基位点的底物就能使产物释放荧光信号的特性，根据检测到的荧光信号强度来确定UDG的活性。首先设计反应底物分子信标，根据最低自由能原理确定分子信标的一级结构顺序，再把一个脱氧尿嘧啶碱基插入到茎环结构的分子信标茎上。这样分子信标底物UDG在37℃保温一段时间后，再用适当浓度的碱处理反应混合液就可使分子信标茎环分离，释放荧光。荧光信号可在荧光检测仪上直接检测出来，无需分离产物。本发明不仅能够很灵敏的检测出纯的UDG，而且还能检测出粗抽提液中UDG的含量。

主权项

1、一种采用分子信标为底物检测尿嘧啶DNA糖苷酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：1)分子信标的设计和合成：首先设计反应底物分子信标，根据最低自由能原理确定分子信标的一级结构顺序，再把一个脱氧尿嘧啶碱基插入到茎环结构的分子信标茎上，分子信标的茎结构两个末端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，且5-9对序列为互补配对；2)被检测DNA样品的制备：针对不同的检测水平制备不同的UDG样品，即制备电泳纯的UDG酶用于检测纯酶活性，或者先构建UDG的突变体菌株，将菌体裂解后的上清液作为样品用于检测粗抽提液中UDG的活性及含量；3)UDG酶切反应：在含有5微升的10x UDG缓冲液的反应混合液中，加入5皮摩尔量的分子信标，再加入2微升的UDG，加水补齐到50微升作为反应体系；共做10个不同UDG浓度的反应体系，另外做一个对照管，即反应体系中不加UDG酶；样品混合后置于37℃暗处温浴30分钟，再分别向反应体系中加入终浓度为0.1M的氢氧化钠，在85℃温育15分钟，最后将反应混合物转移到检测板并用Tris-Cl调节其PH值到7.0，在荧光检测仪上直接读出荧光强度；在检测粗抽提液中UDG活性时需要加入10-20微克的外源ssDNA来保护分子信标底物；4)荧光数值分析：根据所测荧光强度与被检测产物分子含量的线性关系，得到对应某个荧光强度下的产物的分子含量，从而得到被检测样品UDG酶的活性，并且针对不同水平的被检测样品，根据不同的荧光值反映出不同的特性而进行定性分析。