本发明属于生物医药技术领域,特别涉及一种同时检测EGFR多种顺式反式突变组合的引物探针序列组合、试剂盒、方法及应用。所述引物探针序列组合包括SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:5序列;SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为扩增引物对,SEQ ID NO:1为扩增上游引物,SEQ ID NO:2为扩增下游引物;所述扩增引物能特异性扩增包含EGFR 790‑797的片段,且所述引物中的下游引物与所述796‑797野生型特异性Blocker存在至少3个重叠序列;SEQ ID NO:3为790突变型探针,SEQ ID NO:4为790野生型探针;SEQ ID NO:5为796‑797特异性阻遏Blocker。由于本发明的PCR检测灵敏性高,快捷,低成本,可以替代昂贵,费时的二代测序,用于第三代EGFR‑TKI奥西替尼治疗的随访,追踪治疗中抗药基因突变的出现,达到早期发现、及时治疗之目的。