本发明提供了一种可区分牛种和羊种布鲁氏菌的分子标记和检测方法,其中可识别所有种布鲁氏菌的特异性核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:1;用于检测牛种布鲁氏菌的特异性分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:5;用于检测羊种布鲁氏菌的特异性分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。本发明还通过用于检测上述特异性核算片段的引物对和探针。本发明制备的BSCP引物和探针具有通用性,可检测所有种的布鲁氏菌,引物探针不但可以独立使用,也可以制备成三重实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌种的鉴定。检测的样品可以是分离的菌株,也可以是临床收集的流产物、奶、拭子、组织等样品,而且具有高敏感性、高特异性等特点。