本发明公开了一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用。所述引物组合包括特异引物,所述特异引物的核酸序列包括SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.102所示的序列。本发明创造性地设计了用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合,对靶标进行超多重PCR扩增富集以及基于基因测序平台(Illumina)进行序列读取,实现精准灵敏地鉴定结核分枝杆菌复合群及检测耐药基因突变,检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好,且可有效排除同义突变或沉默突变,鉴别耐药突变的同时又可分析异质性突变比例,能够相对真实地反应样本耐药异质性。