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[发明专利]一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用-CN202310897252.8在审
发明人：柴保中;李伟康;李晚军;王晨羽;张伟;王文涛;胡炜杰;廖永康;王凯航 -专利权人：安徽普利药业有限公司
申请日： 2023-07-20 - 公布日： 2023-10-27 - 主分类号： C12N1/19 文献下载
摘要：本发明涉及生物工程领域，具体涉及了一种用于高效发酵制备红景天苷与酪醇的工程菌及其应用，通过敲除酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)trp2、trp3两个色氨酸合成基因以及aro8与aro9这两个芳香族氨基酸转移酶基因；进化aro1基因得到aro1evo基因；强化表达aro1evo、aro10、tyr1基因；敲入ugt85A1基因，构建重组酿酒酵母。本发明基因工程菌株可以高效发酵生产红景天苷与酪醇，经济价值高，适用于工业化生产。
一种用于高效发酵制备红景天工程及其应用

[发明专利]一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用-CN202310779001.X在审
发明人：柴保中;李晚军;李伟康;李娜;张伟;廖永康;王凯航 -专利权人：安徽普利药业有限公司
申请日： 2023-06-28 - 公布日： 2023-10-20 - 主分类号： C12N1/21 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种利用葡萄糖发酵产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法和应用。其中所述工程菌由下述表达方法得到：以野生型大肠杆菌MG1655为底盘细胞，在其染色体上多拷贝异源表达来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)的ectABC基因簇，赋予底盘细胞合成四氢嘧啶的能力，利用强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)调控来源于T7噬菌体的RNA聚合酶，同时结合双T7启动子调控ectABC基因簇高效表达，对支路基因敲除的同时增强表达合成路径关键基因，最终构建获得高产四氢嘧啶的基因重组菌株。罐上发酵48h，四氢嘧啶最高产量达78g/L。该方法具有发酵生产原料价格低廉、培养工艺简单，设备损耗小，单批发酵产量高，成本低，易于实现工业化生产。
一种高产嘧啶基因重组菌株及其构建方法应用

[发明专利]表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α-酮戊二酸的生产方法-CN201910030458.4有效
发明人：王苓;李晚军;伍万兵;曾帅;刘鑫 -专利权人：四川吉晟生物医药有限公司
申请日： 2019-01-11 - 公布日： 2023-03-17 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明提供了表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体、工程菌及应用与α‑酮戊二酸的生产方法，属于分子生物技术及酶工程领域。本发明提供的表达L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组载体，通过在载体中插入调控所述L‑谷氨酸氧化酶基因LGOX和过氧化氢酶基因CAT表达的调控序列SD，提高L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶转化底物生成α‑酮戊二酸的能力，具有较好的实际使用价值。
表达谷氨酸氧化酶过氧化氢酶重组载体工程应用酮戊二酸生产方法

[发明专利]一种生产手性醇的方法-CN202210317424.5在审
发明人：朱逸凡;柴保中;王振栋;范敏华;周学来;李晚军 -专利权人：海南普利制药股份有限公司;浙江普利药业有限公司;安徽普利药业有限公司
申请日： 2022-03-29 - 公布日： 2022-07-29 - 主分类号： C12P7/18 文献下载
摘要：本发明涉及医药化工技术领域，具体涉及一种生产手性醇的方法，所述方法包括采用酮还原酶突变体催化潜手性酮类化合物进行还原反应生产所述手性醇，其中所述酮还原酶突变体为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％以上同一性的氨基酸序列。采用本发明中的方法能够高效生产手性醇，且立体选择性较高，利于工业化生产。
一种生产手性方法

[发明专利]一种酮还原酶突变体-CN202210318014.2在审
发明人：朱逸凡;柴保中;王振栋;范敏华;周学来;李晚军 -专利权人：海南普利制药股份有限公司;浙江普利药业有限公司;安徽普利药业有限公司
申请日： 2022-03-29 - 公布日： 2022-07-29 - 主分类号： C12N9/02 文献下载
摘要：本发明涉及应用微生物与酶工程领域，具体包括一种重组酮还原酶及其突变体。其中，该酮还原酶突变体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其包括突变位点T67R。上述获得的突变体能够以酮类化合物为原料，通过不对称还原，高效生产手性醇，且立体选择性较高，利于工业化生产。
一种还原酶突变体

[发明专利]γ-氨基丁酸的制备方法、全细胞催化剂及应用-CN202210373989.5在审
发明人：张瑞;李晚军;李倩;刘鹏;曾帅 -专利权人：绵阳晟氏健康科技有限公司
申请日： 2022-04-11 - 公布日： 2022-06-24 - 主分类号： C12P13/00 文献下载
摘要：本发明公开了一种γ‑氨基丁酸的制备方法、全细胞催化剂及应用，制备方法包括全细胞催化剂制备：利用自转运蛋白AIDA‑1作为载体蛋白，将谷氨酸脱羧酶表达展示在细胞表面，得到全细胞催化剂；γ‑氨基丁酸制备：以L‑谷氨酸或其盐为底物，在全细胞催化剂作用下催化转化，生成γ‑氨基丁酸。通过表面表达展示技术，将谷氨酸脱羧酶表达展示在细胞表面，在催化转化过程中能够直接与底物发生反应，避免在细胞内表达时出现的交叉反应；相较于胞内表达的酶蛋白相比，本发明的表面表达展示方法更有利于谷氨酸脱羧酶酶的折叠、溶解，利用可溶性表达，同时更有利于谷氨酸脱羧酶活性与稳定性的维持，避免包涵体的形成。
氨基丁酸制备方法细胞催化剂应用

[发明专利]酶法生产DL-酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用-CN202110290551.6有效
发明人： 李晚军;曾帅;刘鹏;张瑞 -专利权人：绵阳晟氏健康科技有限公司
申请日： 2021-03-18 - 公布日： 2022-05-17 - 主分类号： C12N9/90 文献下载
摘要：本发明公开了酶法生产DL‑酪氨酸的方法及广谱型氨基酸消旋酶、应用，酶法生产DL‑酪氨酸的方法，包括以下步骤：S1、构建重组表达载体pET32a‑PH0138，转化到大肠杆菌BL21(DE3)/pG‑KJE8中，获得重组工程菌BBAR；S2、发酵表达BAR酶的重组工程菌BBAR获得湿菌体；S3、将湿菌体混悬后进行破碎处理，破碎液为含有广谱型氨基酸消旋酶的粗酶液；S4、向步骤S3获得的粗酶液中添加L‑酪氨酸和PLP，搅拌转化，直至比旋光度为0°时终止反应，获得DL‑酪氨酸水溶液。该方法具有原料价格低廉、转化率高，后处理简便的优势，产品质量高，适合工业化大生产。
生产 dl 酪氨酸方法广谱氨基酸消旋酶应用

[发明专利]一种生物酶法合成D-苹果酸的方法-CN201811562095.0有效
发明人： 李晚军;王苓;伍万兵;陈纹锐;张丽 -专利权人：四川同晟生物医药有限公司
申请日： 2018-12-20 - 公布日： 2022-04-22 - 主分类号： C12P7/46 文献下载
摘要：本发明公开了一种生物酶法合成D‑苹果酸的方法，属于有机酸制备领域，具体涉及一种用大肠杆菌工程菌全细胞酶法制备D‑苹果酸的方法。本发明利用基因工程手段在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌中共表达了马来酸水合酶的大小亚基，通过生物发酵获得过表达马来酸水合酶的菌体，全细胞生物酶法转化马来酸合成D‑苹果酸，产量为200.17g/L，转化率高达99.97％。本发明构建基因工程菌培养条件简单，发酵周期短，发酵成本低，易于实现菌体高密度发酵，菌体收率高，底物转化率高，有利于生物酶法合成D‑苹果酸的产业化大规模生产。
一种生物酶合成苹果酸方法

[发明专利]固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用-CN202110290552.0在审
发明人： 李晚军;刘鹏;曾帅;李倩;张瑞 -专利权人：绵阳晟氏健康科技有限公司
申请日： 2021-03-18 - 公布日： 2021-06-25 - 主分类号： C12N9/90 文献下载
摘要：本发明公开了固定化精氨酸消旋酶及其制备方法、应用，固定化精氨酸消旋酶的制备方法，包括以下步骤：S1、将产精氨酸消旋酶的大肠杆菌发酵液制备成重悬液；S2、将步骤S1获得的重悬液依次经过破胞、絮凝获得粗酶液；S3、向步骤S2获得的粗酶液中加入环氧型固定化酶载体，搅拌，加入三水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾固体，继续搅拌固定化，一段时间后进行固液分离，获得固定化精氨酸消旋酶。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶与游离精氨酸消旋酶酶相比具有更佳的热稳定性、保存稳定性。本方法制备的固定化精氨酸消旋酶催化L‑精氨酸生成DL‑精氨酸方法简单，后处理工艺步骤少且固定化酶可以重复使用，大大降低了转化成本，特别适合大规模工业化生产。
固定精氨酸消旋酶及其制备方法应用

[发明专利]酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体-CN202110290561.X在审
发明人：李倩;李晚军;唐德强;刘鹏 -专利权人：绵阳晟氏健康科技有限公司
申请日： 2021-03-18 - 公布日： 2021-06-22 - 主分类号： C12P19/30 文献下载
摘要：本发明公开了一种酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法和用于该方法的转化体，一种酶法生产烟酰胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：S1、分别构建重组表达载体pET15b‑nadV、重组表达载体pET28a(+)‑Amn和重组表达载体pET28a(+)‑Prs，转化到大肠杆菌中，获得重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs；S2、分别发酵表达重组工程菌nadV、重组工程菌Amn和重组工程菌Prs，获得湿菌体；S3、分别对三种湿菌体进行破碎处理，获得三种粗酶液；S4、将三种粗酶液与烟酰胺、ATP、AMP、MgCl2、KCl和Tris‑HCl缓冲液混合，搅拌均匀后进行反应，控制反应温度为30‑50℃，维持pH值为6.5‑8.5，反应2‑8小时获得烟酰胺单核苷酸粗产品。本发明不使用价格较高且来源受限的底物作为起始原料，价格低廉、绿色环保，适宜大规模工业化生产。
生产烟酰胺单核苷酸方法用于转化

[发明专利]一种酶法制备D-谷氨酸的方法-CN202110290569.6在审
发明人：曾帅;李晚军;肖雪;范明 -专利权人：绵阳晟氏健康科技有限公司
申请日： 2021-03-18 - 公布日： 2021-05-28 - 主分类号： C12P13/14 文献下载
摘要：本发明公开了一种酶法制备D‑谷氨酸的方法，包括以下步骤：S1、以L‑谷氨酸钠为底物，加入谷氨酸消旋酶使其反应生成DL‑谷氨酸钠；S2、加入L‑谷氨酸脱羧酶，使DL‑谷氨酸钠分解成γ‑氨基丁酸和D‑谷氨酸，控制pH值为2‑4，析出D‑谷氨酸晶体。本发明利用谷氨酸消旋酶，L‑谷氨酸脱羧酶，以L‑谷氨酸钠为底物，制备D‑谷氨酸，基于简单的方法，即可制备D‑谷氨酸，具有环境污染小，生物安全性好，设备简单的优点，有利于工业化大生产D‑谷氨酸及其衍生物。
一种法制谷氨酸方法

[发明专利]用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法-CN201510755912.4有效
发明人： 李晚军;王钦芳;范明;陈纹锐 -专利权人：四川同晟生物医药有限公司
申请日： 2015-11-09 - 公布日： 2019-01-15 - 主分类号： C12N15/70 文献下载
摘要：本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，本发明提供一种γ‑谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述质粒中的目的基因序列经过了优化，在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ‑谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ‑谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。本发明还提供了一种茶氨酸基因工程菌及其配套的培养方法，该基因工程菌由γ‑谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。
用于氨酸生产质粒及其相应工程构建使用方法

[发明专利]一种共表达L-乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法-CN201810629658.7在审
发明人：王苓;李晚军;刘超;曾帅;刘鑫;杨顺楷;陈纹锐 -专利权人：四川同晟生物医药有限公司
申请日： 2018-06-19 - 公布日： 2018-11-20 - 主分类号： C12P7/40 文献下载
摘要：本发明属于酶催化技术领域，具体涉及一种共表达L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶偶联生产丙酮酸钠的方法。针对现有的丙酮酸的合成方法中酶法转化法的成本较高而不适于工业化的问题，本发明的技术方案是：[1]构建L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体，转化到大肠杆菌中；[2]将步骤[1]得到大肠杆菌高密度发酵的获得L‑乳酸氧化酶和过氧化氢酶共表达的大肠杆菌工程菌；[3]将步骤[2]得到的大肠杆菌工程菌的湿菌体投入L‑乳酸钠溶液中，通无菌空气搅拌转化，得到转化液；[4]将步骤[3]得到的转化液通过微虑超滤除去菌体及蛋白，通过除杂和醇沉得到丙酮酸钠。本发明适用于丙酮酸钠的工业生产。
过氧化氢酶乳酸氧化酶共表达大肠杆菌工程菌大肠杆菌生产丙酮酸丙酮酸钠转化液偶联高密度发酵共表达载体乳酸钠溶液酶法转化无菌空气丙酮酸酶催化湿菌体超滤醇沉构建菌体转化蛋白合成

[发明专利]一种生物酶法转化生产β-丙氨酸和D-天冬氨酸的方法-CN201810629645.X在审
发明人： 李晚军;王苓;刘超;曾帅;刘鑫;杨顺楷;陈纹锐 -专利权人：四川同晟生物医药有限公司
申请日： 2018-06-19 - 公布日： 2018-11-20 - 主分类号： C12P13/06 文献下载
摘要：本发明属于酶催化技术领域，特别涉及一种生物酶法转化生产β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的方法。针对现有的生物酶法合成β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的方法要么产率过低，要么在生物转化过程中必须不间断地人工添加固体底物，皆不适宜于工业化的问题，本发明的技术方案是：包括如下步骤：[1]进行高密度发酵获得过表达L‑天冬氨酸脱羧酶的大肠杆菌工程菌；[2]利用大肠杆菌工程菌以DL‑天冬氨酸为底物进行生物转化，在转化过程中流加DL‑天冬氨酸钠溶液进行补加底物，同时通过流加DL‑天冬氨酸盐酸盐溶液控制转化体系pH，获得β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸。将底物替换为L‑天冬氨酸能够单独合成得到β‑丙氨酸。本发明适用于β‑丙氨酸和D‑天冬氨酸的合成。
天冬氨酸丙氨酸生物酶法底物大肠杆菌工程菌合成转化生物转化过程高密度发酵盐酸盐溶液固体底物生物转化转化体系酶催化钠溶液脱羧酶补加产率流加替换生产

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