本发明涉及一种侧柏DNA条形码及其在亲缘关系鉴定中的方法与应用,涉及生物技术领域。所述DNA条形码为核苷酸序列SEQ ID NO.1所示的侧柏trnS‑trnG spacer+intron序列片段、SEQ ID NO.2所示的侧柏trnT‑5’trnL序列片段、SEQ ID NO.3所示的侧柏RbcL序列片段,所述DNA条形码引物根据以上3个序列设计而成。本发明获得的DNA条形码及其叶绿体DNA引物可以从母系遗传的角度评价侧柏的遗传多样性水平,解析侧柏群体在叶绿体DNA水平上的遗传多样性,对于侧柏属种质资源遗传多样性保护和有效利用具有重要意义。