本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域,特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用,DUSP9的基因的序列为SEQ ID NO:1。其筛选方法包括以下步骤:进行预实验,获得sgRNA文库的最佳MOI,确定乐伐替尼的浓度;进行感染Cas9文库实验,得到稳定株;稳定株加入乐伐替尼处理,通过PCR扩增和高通量测序,分析sgRNA的富集情况;筛选乐伐替尼耐药基因;有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因,为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据,为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点,为临床合理用药提供指导。