本发明公开了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、试剂盒及应用,涉及分子生物学技术领域。其包括第一引物对和第二引物对,第一引物对具有如SEQ ID NO.1‑2所示的序列,第二引物对具有如SEQ ID NO.3‑4所示的序列。本发明提供的巢式PCR扩增引物组合可以用于副猪嗜血杆菌的快速检测,具有较好的检测灵敏度和准确度,经验证,本发明提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度,比普通PCR扩增的灵敏度高100倍,且该扩增引物的特异性强,重复性好,可以应用于猪场日常检测,为副猪嗜血杆菌的临床诊断提供技术支持。