本发明公开了一种猴痘病毒的多重荧光PCR检测引物、探针及其检测方法和应用，具体涉及生物技术领域。猴痘病毒的上游扩增引物MPXV‑F01如SEQ ID NO.1所示，下游扩增引物MPXV‑R01如SEQ ID NO.2所示；猴痘病毒西非分支的上游扩增引物MPXV‑WA‑F如SEQ ID NO.3所示，下游扩增引物MPXV‑WA‑R2如SEQ ID NO.4所示；猴痘病毒刚果分支的上游扩增引物MPXV‑CB‑F如SEQ ID NO.5所示，下游引物MPXV‑CB‑R1如SEQ ID NO.6所示。本发明检测方法的灵敏度高；反应快速：＜45min；特异性好：与其它样本/核酸无交叉；是首个西非型（致死率1%）和刚果分支（致死率10%）的检测方法。本发明开展猴痘PCR诊断方法的研究符合检验检疫部门的实际情况，能够满足检验检疫部门的工作需要。
