本发明公开了一种露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553单端孢霉烯合酶基因Tri5启动子及其应用。该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过染色体步移技术获得Tri5基因的上游启动子序列并进行启动子核心区域预测,获得露湿漆斑菌A553单端孢霉烯合酶基因Tri5启动子Tri5P。本发明的启动子能够高效启动潮霉素抗性基因hph的表达,且启动效率与组成型启动子TEF1相近,从而为后期通过转录调控和异源表达以提高单端孢霉烯毒素产量并获得更多高活性的新型单端孢霉烯毒素奠定分子生物学基础。