本发明公开了一种引物组合及利用其鉴定硫酸软骨素生物来源的方法。所述引物组合包括至少一引物对,所述引物对包括上游引物和下游引物,其中所述上游引物选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一种或多种;所述下游引物选自如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10所示的核苷酸序列中的一种或多种。本发明还公开了包含所述引物组合的试剂盒,以及所述引物组合、试剂盒在鉴定硫酸软骨素生物来源中的应用。本发明能较好地对市场上鲨鱼、鸡、猪、牛来源的硫酸软骨素进行鉴别,尤其是对DNA含量过低或破坏严重的硫酸软骨素样品进行生物来源鉴定。