本发明公开了一种针对可以同时检测猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、经典猪瘟病毒（CSFV）和猪乙型脑炎病毒（JEV）的多重RT‑qPCR试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括如序列表SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的引物和探针。所述的检测方法是将血液、脑组织、肝、肺、脾、肾、淋巴结、扁桃体等猪组织作为待测样品，先进行总DNA/RNA提取，然后将得到的总DNA/RNA作为模版，再加入上述引物和探针配制得到扩增反应液进行RT‑qPCR扩增，通过读取荧光定量PCR仪自带软件绘制的扩增曲线所对应的Ct值来进行结果判定，从而确定区分以上病毒。本发明具有灵敏度高、特异性高、操作简单的优点，可以同时、快速、准确的检测四种病毒，为实验室检测区分这四种病毒提供了有效的技术手段。
