本发明涉及分子生物学领域,具体涉及一种聚合酶活性测定方法及试剂盒。本发明所提供的模板‑引物核酸分子,所述模板‑引物核酸分子包括模板链和引物链;所述模板链包括与引物链配对的模板配对区和单链区,所述单链区为多个重复单元组成的单链核苷酸序列,所述重复单元是长度为1~10bp的单链核苷酸序列,所述引物链的碱基序列为gcagagag,具体如SEQ ID NO:1所示,其能够用于聚合酶活性的测定,且其能够避免单链区形成二级结构从而导致活性测定不准确的问题,本发明所提供的聚合酶活性检测方法,无需涉及到同位素标记等,安全无毒,成本低。