本发明提供一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法,涉及基因工程技术领域。根据野生型鼠白血病逆转录酶的蛋白质结构特点,对特定活性位点进行定点突变,得到本申请的突变型逆转录酶。其中,该突变型逆转录酶核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。突变位点包括第66位、第69位、第197位、第288位、第291位、第292位、第302位、第313位、第326位、第334位、和第524位。该突变型逆转录酶具有良好的热稳定性,有助于提升cDNA的合成效率和合成质量,保真性高。此外,该逆转录酶抗干扰性强,具有良好的抑制剂耐受性,且能够应用于一步法RT‑PCR技术中。