本发明涉及用于检测空间环境中的真菌的引物组合、试剂盒及方法。本发明所述引物组合包括引物F3、B3、FIP和BIP,其中,引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明所述引物组合、试剂盒以及检测方法能够同时对空间环境中常见的多种真菌进行LAMP检测,具有检测范围广、特异性好、灵敏度高、检测周期短、不存在二次污染等优点,特别适合在空间中进行在轨实时检测。