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[发明专利]PE-Nt4引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用-CN202310298314.3在审
发明人： 杨进孝;徐雯;杨永星;李璐;张成伟;张璐 -专利权人：北京市农林科学院;北京农科院种业科技有限公司
申请日： 2023-03-24 - 公布日： 2023-07-25 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了PE‑Nt4引导编辑系统及其在基因组碱基编辑中的应用。所述PE‑Nt4引导编辑系统包括nesgRNA、pegRNA、融合蛋白和紫色筛选标记蛋白PAP1，其中，融合蛋白依次包括M‑MLV RT、Cas9n(H840A)、P2A和潮霉素磷酸转移酶。通过实验证明：与PE‑Nt2和PE‑Nt3相比，PE‑Nt4引导编辑系统对烟草靶点的编辑效率显著提高。同时，PAP1基因表达会导致花青素的合成，形成肉眼可辨的紫色，不仅可用于阳性T0苗的直接筛选，还可用于直接剔除含有转基因标签的T1苗。更为重要的是，本发明利用PE‑Nt4系统在双子叶植物中实现了目标碱基突变的稳定遗传。
pe nt4 引导编辑系统及其基因组碱基中的应用

[发明专利]NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用-CN201911405272.9有效
发明人：徐雯;杨进孝;武莹;张成伟;康桂婷;刘亚 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-12-31 - 公布日： 2023-06-23 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了NTS/dNTS组合在制备植物突变体中的应用。该方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中；esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；DNA片段甲靶点序列位于植物基因组中的转录链上；供体DNA的转录链依次由DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列组成；DNA片段乙为将DNA片段甲突变后得到的DNA分子；在esgRNA引导下，Cas9切刻酶在植物基因组的非转录链上产生一个单链DNA切刻，在供体DNA的非转录链上产生两个单链DNA切刻，通过植物体内的修复机制将植物基因组中DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。
nts dnts 组合制备植物突变体中的应用

[发明专利]一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法-CN201911411090.2有效
发明人： 杨进孝;赵久然;宋伟;宋金岭;冯峰 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-12-31 - 公布日： 2023-06-06 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了一种通过优化供体DNA模板来提高基因精确替换效率的方法。该方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入植物中；esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；DNA片段甲靶点序列位于植物基因组中的非转录链上；供体DNA的转录链依次由DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列组成；DNA片段乙为将DNA片段甲突变后得到的DNA分子；在esgRNA引导下，Cas9切刻酶在植物基因组的转录链上产生一个单链切刻，在供体DNA的非转录链上产生两个单链切刻，通过植物体内的修复机制将植物基因组中DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。
一种通过优化供体 dna 模板提高基因精确替换效率方法

[发明专利]一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法-CN202211488466.1在审
发明人： 杨进孝;徐雯;赵久然;杨永星;张璐 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2022-11-25 - 公布日： 2023-05-02 - 主分类号： C12N9/22 文献下载
摘要：本发明公开了一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法。本发明为了进一步提高引导编辑系统的编辑效率，在PE‑P6引导编辑系统的基础上敲除了水稻MMR修复基因，得到引导编辑系统PE‑P6ΔOsMLH1RT‑S和引导编辑系统PE‑P6ΔOsMLH1RT‑M。与PE‑P6引导编辑系统相比，敲除OsMLH1基因后，引导编辑系统PE‑P6ΔOsMLH1RT‑S和PE‑P6ΔOsMLH1RT‑M能够进一步提升靶点的编辑效率；并且引导编辑系统PE‑P6ΔOsMLH1RT‑M能够最大程度地提高水稻靶点的编辑效率。
一种提高引导编辑系统碱基效率方法

[发明专利]xCas9n-epBE碱基编辑系统及其在基因组碱基替换中的应用-CN201910812765.8有效
发明人： 杨进孝;张成伟;徐雯;吕欣欣;李璐 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-08-30 - 公布日： 2023-03-14 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了xCas9n‑epBE碱基编辑系统及其在基因组碱基替换中的应用。本发明公开的xCas9n‑epBE碱基编辑系统包括xCas9n、PmCDA1、UGI和tRNA‑esgRNA组成；所述tRNA‑esgRNA靶向靶点序列；所述tRNA‑esgRNA如式I所示：tRNA‑所述靶点序列转录的RNA‑esgRNA骨架(式I)。通过实验证明：本发明的xCas9n‑epBE碱基编辑系统可在植物基因组中实现靶点序列的编辑，尤其是在PAM序列为GAC或GAG时实现靶点序列中碱基C到碱基T的碱基替换。本发明的xCas9n‑epBE碱基编辑系统在植物或动物基因组碱基替换中具有广泛的应用前景。
xcas9n epbe 碱基编辑系统及其基因组替换中的应用

[发明专利]一种核定位信号F4NLS及其在提高碱基编辑效率与拓展可编辑碱基范围中的应用-CN201911323222.6有效
发明人： 杨进孝;王飞鹏;赵久然;张成伟;徐雯 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-12-20 - 公布日： 2023-03-14 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种核定位信号F4NLS及其在提高碱基编辑效率与拓展可编辑碱基范围中的应用。所述核定位信号F4NLS由核定位信号甲和核定位信号乙组成，所述核定位信号甲包括3*Flag标签蛋白和NLS蛋白；所述核定位信号乙包括所述NLS蛋白；所述3*Flag标签蛋白的氨基酸序列为序列10第1‑22位；所述NLS蛋白的氨基酸序列为序列11第1‑7位。通过实验证明：本发明的核定位信号F4NLS可提高碱基编辑效率和拓展可编辑碱基范围，在生物基因组编辑领域具有良好的应用前景。
一种核定信号 f4nls 及其提高碱基编辑效率拓展范围中的应用

[发明专利]一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用-CN201911200779.0有效
发明人：张成伟;徐雯;刘亚;赵思;杨进孝 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-11-29 - 公布日： 2023-01-03 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明提供了一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用。所述sgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA‑改造的sgRNA骨架(式I)；所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14‑15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18‑19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为3nt；所述sgRNA骨架为序列9所示的RNA分子。通过实验证明：本发明的改造的sgRNA可显著提高胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的C·T碱基替换效率，最高可达86.4％。
一种高效 sgrna 及其基因编辑中的应用

[发明专利]一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用-CN201911202321.9有效
发明人：徐雯;王飞鹏;康桂婷;宋金岭;李璐;杨进孝 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-11-29 - 公布日： 2022-12-27 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明提供了一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用。所述改造的sgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA‑改造的sgRNA骨架(式I)；所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14‑15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18‑19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为5nt；所述sgRNA骨架为序列9所示的RNA分子。通过实验证明：本发明的改造的sgRNA可显著提高胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的C·T碱基替换效率，最高可达81.8％。
一种改造 sgrna 及其提高碱基编辑效率中的应用

[发明专利]xCas9n-epBE碱基编辑系统在基因编辑中的应用-CN201910812816.7有效
发明人： 杨进孝;徐雯;刘亚;王飞鹏;袁爽 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-08-30 - 公布日： 2022-12-20 - 主分类号： C12N15/84 文献下载
摘要：本发明公开了xCas9n‑epBE碱基编辑系统在基因编辑中的应用。本发明公开的xCas9n‑epBE碱基编辑系统包括xCas9n、PmCDA1、UGI和tRNA‑esgRNA；所述tRNA‑esgRNA靶向靶点序列；所述tRNA‑esgRNA如式I所示：tRNA‑所述靶点序列转录的RNA‑esgRNA骨架(式I)。通过实验证明：本发明的xCas9n‑epBE碱基编辑系统在植物基因组中实现了靶点序列的编辑，尤其是在PAM序列为NGT、NGA、NGG、GAA或GAT时实现了靶点序列中由碱基C到碱基T的替换。本发明的xCas9n‑epBE碱基编辑系统在植物或动物基因编辑中具有广泛的应用前景。
xcas9n epbe 碱基编辑系统基因中的应用

[发明专利]一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法-CN201911405281.8有效
发明人： 杨进孝;徐雯;康桂婷;李璐;赵思 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2019-12-31 - 公布日： 2022-10-21 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明提供了一种不产生DNA双链断裂的实现基因替换的方法。所述方法包括如下步骤：将sgRNA、Cas9切刻酶、供体DNA导入目的植物中；sgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；供体DNA依次包括DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列；DNA片段乙为将DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；在sgRNA引导下，Cas9切刻酶在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。
一种产生 dna 断裂实现植物基因替换方法

[发明专利]xCas9基因编辑系统在基因组编辑中的应用-CN202011398790.5有效
发明人： 杨进孝;张成伟;刘新香;刘亚 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2020-12-02 - 公布日： 2022-09-16 - 主分类号： C12N15/84 文献下载
摘要：本发明公开了xCas9基因编辑系统在基因组编辑中的应用。所述xCas9基因编辑系统包括xCas9和sgRNA。所述基因组编辑的方法包括如下步骤：将xCas9和sgRNA导入生物体或生物细胞内，实现基因组靶点序列的编辑；所述编辑为使所述靶点序列或其邻近序列发生碱基插入和/或缺失；所述sgRNA靶向靶点序列；所述靶点序列的PAM序列为GAD或NGN；D为G、T或A；N为A、T、C或G。通过实验证明：本发明的xCas9基因编辑系统可对位于生物基因组上的PAM序列为GAD或NGN的靶点序列或其邻近序列进行编辑，大大拓展了可编辑靶点的范围。
xcas9 基因编辑系统基因组中的应用

[发明专利]MG132在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用-CN201811634020.9有效
发明人：武莹;杨进孝;刘亚;康桂婷;吕欣欣 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2018-12-29 - 公布日： 2022-08-16 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了MG132在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用。实验证明，MG132可以提高碱基编辑系统编辑效率、增加碱基编辑系统碱基替换纯度和扩大碱基编辑系统突变窗口范围，进而高效获得突变位点更多的突变体。本发明具有重要的应用价值。
mg132 碱基编辑系统受体基因组中的应用

[发明专利]SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用-CN201811634063.7有效
发明人： 杨进孝;武莹;宋伟;袁爽;王飞鹏 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2018-12-29 - 公布日： 2022-08-16 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了SCR7在碱基编辑系统编辑受体基因组中的应用。实验证明，SCR7可以提高碱基编辑系统编辑效率和扩大碱基编辑系统突变窗口范围，进而获得含有更多突变位点的突变体。本发明具有重要的应用价值。
scr7 碱基编辑系统受体基因组中的应用

[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9技术高效创制香味玉米的方法-CN202110510545.7有效
发明人：赵久然;杨进孝;张翔;史亚兴;卢柏山;武莹;刘亚;王元东 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2021-05-11 - 公布日： 2022-07-22 - 主分类号： C12N15/113 文献下载
摘要：本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术高效创制香味玉米的方法。本发明对玉米ZmBADH2‑1基因和ZmBADH2‑2基因的外显子区域设计靶点并构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，通过遗传转化获得双基因敲除突变体。通过实验证明：4个T1代双基因敲除突变体的籽粒中，2‑AP含量最高为438.29μg·kg‑1、最低为161.82μg·kg‑1，而未经过编辑的京724中未检测到2‑AP。本发明利用CRISPR/Cas9技术从分子遗传学层面定向、高效地改良玉米香味性状，高效创制出不同香味梯度的玉米骨干亲本新种质，为香型玉米品种的开发和玉米食味品质的提升提供了新的育种材料。
一种利用 crispr cas9 技术高效创制香味玉米方法

[发明专利]一种基因编辑效率提高的引导碱基编辑系统及其应用-CN202011621689.1在审
发明人：徐雯;杨进孝;杨永星;康桂婷;李璐 -专利权人：北京市农林科学院
申请日： 2020-12-31 - 公布日： 2022-07-19 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了一种基因编辑效率提高的引导碱基编辑系统及其应用。所述引导碱基编辑系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述pegRNA包括esgRNA、逆转录模板序列和引物结合位点序列；所述逆转录模板序列中引入的突变碱基包括在目标突变位点引入的突变碱基和在目标突变位点以外的其它位点引入的额外的突变碱基。通过实验证明：该引导碱基编辑系统可显著提高PE‑P2或PE‑P3引导编辑系统的编辑效率。
一种基因编辑效率提高引导碱基系统及其应用

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