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[发明专利]利用烟草脆裂病毒同时表达两种外源蛋白的载体构建法-CN202110836772.9有效
发明人： 廖乾生;郭歌;常发光;赖家良;杜志游 -专利权人：浙江理工大学
申请日： 2021-07-23 - 公布日： 2023-05-02 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了一种同时非融合表达两个外源蛋白载体pTRV2e3的构建方法：以TRV基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，采用病毒基因缺失策略构建包含TRV的2b和2c基因启动子载体pTRV2e3。本发明还同时提供了利用pTRV2e3制备能同时表达GFP和RFP的病毒TRVe3‑rfp‑gfp的方法，病毒TRVe3能在寄主植物中持续稳定高含量表达两个非融合的目的蛋白。
利用烟草病毒同时表达两种外源蛋白载体构建

[发明专利]同时表达3个非融合外源蛋白病毒载体TRVeΔCP-CN202211022069.5在审
发明人： 廖乾生;郭歌;赖家良;夏涛 -专利权人：浙江理工大学
申请日： 2022-08-25 - 公布日： 2023-04-11 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明涉及分子生物学领域，具体包括基于烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)构建在整个植物中同时快速表达3个非融合外源蛋白的构建方法。本发明公开一种利用TRV基因组RNA2中的3个SGP驱动3外源基因在整个植物中同时表达病毒载体TRVeΔCP的构建方法。TRVeΔCP在番茄中不产生明显的症状反应，携带3个外源基因的TRVeΔCP系统性侵染寄主植物，并同时表达目的蛋白。本发明首次利用缺失替换和病毒亚基因组翻译策略构建在整个寄主植物中同时快速、高含量表达3个非融合蛋白的植物病毒载体TRVeΔCP。
同时表达融合蛋白病毒载体 trve base sup cp

[发明专利]基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体的构建与应用-CN202210682700.8在审
发明人： 廖乾生;郭歌;赖家良;杜志游 -专利权人：浙江理工大学
申请日： 2022-06-16 - 公布日： 2022-10-11 - 主分类号： C12N15/83 文献下载
摘要：本发明涉及分子生物学领域，本发明公开了一种基于TRV的CRISPR/Cas12a基因组编辑载体构建方法：利用质粒pTRV2e3构建表达Cas12a蛋白和表达Cas12a蛋白并转录crRNA载体，并通过重组病毒TRVe3在植物中表达Cas12a蛋白和转录crRNA，对靶标基因进行定点编辑。本发明利用病毒TRVe3在表达外源蛋白速度快与含量高的特点对寄主植物的靶标基因进行定点编辑。
基于 trv crispr cas12a 基因组编辑载体构建应用

[发明专利]同时表达两个外源蛋白载体TRVe2-CN201810261990.2有效
发明人： 廖乾生;常发光;杜志游;刘小红;林福呈 -专利权人：浙江理工大学;浙江大学
申请日： 2018-03-28 - 公布日： 2021-09-21 - 主分类号： C12N15/82 文献下载
摘要：本发明公开了一种同时表达两个外源蛋白载体TRVe2的构建方法，以TRV的基因组RNA2的农杆菌侵染性克隆pYL156为材料，构建含有TRV的2b基因启动子和豌豆早枯病毒外壳蛋白基因启动子序列的载体，通过这2个植物病毒的基因组启动子驱动外源基因在本氏烟中表达。本发明的同时表达2个非融合蛋白的植物病毒TRV2e2在国际上首次报道；该病毒在本氏烟不引起明显的症状，携带2个外源基因后能系统性扩展至整个植株，并在同一个细胞中表达2个外源蛋白。
同时表达两个蛋白载体 trve base sup

[发明专利]检测外源基因的核酸杂交膜条及其应用-CN201110096034.1无效
发明人：陈集双;田庆常;廖乾生;何珣 -专利权人：南京工业大学
申请日： 2011-04-18 - 公布日： 2011-09-21 - 主分类号： C12Q1/68 文献下载
摘要：本发明涉及一种检测外源基因的核酸杂交膜条及其应用，属于生物工程领域。本发明所述的膜条上的每一条特异性捕获探针有30-37个碱基，分别针对一种转入到植物中的外源基因，在探针的5′端加oligo(dt)n并用氨基标记。本发明系统检测植物外源基因包括以下步骤：探针设计、探针合成、核酸杂交膜条制备、探针固定、样品NDA提取、样品NDA标记、杂交和显色。植物外源基因检测过程无放射性同位素，且杂交、显色和相应的洗涤步骤是在封闭的一次性微管中进行，检测结果可肉眼观察，检测过程方便、安全。本发明可用于植物种子、食品及其加工过程、观赏型植物繁殖体等植物种质资源和产品的外源基因检测。
检测基因核酸杂交及其应用

[发明专利]一种快速扩增双链RNA靶序列的方法-CN200610053618.X无效
发明人：陈集双;唐香山;竺锡武;陈绍宁;刘伟侠;廖乾生;冯俊丽 -专利权人：浙江理工大学
申请日： 2006-09-27 - 公布日： 2007-04-04 - 主分类号： C12P19/34 文献下载
摘要：本发明公开了一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，步骤包括：(1)dsRNA的制备；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物。本发明以dsRNA作为模板，充分利用了dsRNA的稳定性；利用TaqDNA聚合酶既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性的特点，省去了反转录过程；实验所需试剂少，操作简单，所用时间短，达到了省时、省钱、省力的效果。
一种快速扩增 rna 序列方法

[发明专利]构建植物病毒弱病毒株的方法-CN200510048952.1无效
发明人：陈集双;竺锡武;金波;廖乾生;商晗武;陈海敏 -专利权人：浙江理工大学
申请日： 2005-01-12 - 公布日： 2005-08-17 - 主分类号： C12N7/01 文献下载
摘要：本发明公开了一种构建植物病毒弱病毒株的方法。步骤如下：1)根据植物病毒卫星RNA两端保守序列，设计PCR引物，进行RT－PCR扩增，获得卫星RNA的cDNA，将全长卫星RNA的cDNA构建到质粒上，然后进行测序，确定其序列；2)将全长卫星RNA的cDNA或者序列改造后的cDNA进行体外转录，获得纯化的卫星RNA转录产物；3)预先接种强毒株至系统寄主，在接种叶或邻近叶片上，再接种上述体外转录的卫星RNA转录产物获得假重组，假重组后，取接种叶扩大接种，获得具备卫星RNA的弱病毒株。本发明的方法大大提高筛选植物病毒弱病毒株的速度，通过在cDNA水平上的卫星RNA序列改造，可以获得性状更优的卫星RNA变异株，提高卫星RNA介导的弱病毒保护效果，明显提高果实品质。
构建植物病毒方法