本发明公开了去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体及其编码基因与应用,属于酶工程技术领域。本发明去乙酰氧基头孢菌素C合成酶突变体氨基酸序列以SEQ ID NO.1为参考,具有位于第72位苏氨酸T72、第92位甘氨酸G92中的至少一个突变;第72位苏氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸,第92位甘氨酸突变为除其自身以外任意一种天然氨基酸。本发明通过对棒状链霉菌的去乙酰氧基头孢菌素C合成酶进行定点突变和基因工程改造,提高了该酶对青霉素G的催化活性,并且可提高产黄支顶孢霉头孢菌素C的产量,适于商业和工业应用。