本申请涉及生物信息技术领域,尤其涉及基于全基因组测序的多态性分子标记和制备方法及应用;所述分子标记包括81组引物对,引物对的序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.162所示;所述方法包括:将五丰B和广恢308的基因组DNA建库和测序,得到原始数据,质控筛选,得到有效数据;将有效数据和参考基因组比对组装,得到比对文件;得到五丰B和广恢308的一致性序列;比对一致性序列,得到InDel位点;根据InDel位点,得到设计引物序列;将设计引物序列在基因组中检索比对,得到标记引物;PCR扩增和电泳检测,得到电泳结果图;根据电泳结果图,判断标记引物是否为多态性分子标记;所述应用包括:将分子标记用于水稻遗传图谱构建、QTL定位、分子标记辅助育种及遗传多样性分析中。