[发明专利]高亲和力抗体

说明书

发明领域

本发明涉及抗体及其治疗用途。

发明背景

抗体曾经长期被认为是治疗癌症和其它疾病潜在的有力工具。然而，尽管存在一些明显的例外，这种潜力尚未获得普遍的认识。

这种成功的相对缺乏可能至少在某种程度上是由于使用了来源于啮齿类的单克隆抗体，该抗体很少具有高于10^-9M的亲和力。具有这种亲和力水平的抗体治疗效用有限，因为已证明很难将足够的抗体运送至靶标以实现有用的生物学活性。抗体与抗原结合是可以逆转的，并且在体内实际使用的抗体浓度下，更倾向于解离而不是结合。原则上，有可能通过增加抗体浓度来抵消抗原的解离。然而，这可能会引起无法接受的临床副作用并且也将增加治疗相关的费用。

发明概述

本发明基于如下认识：可生产“酸耐受性”抗体或其片段，并且这种酸耐受性与抗体和抗原的高亲和力结合有关。

根据本发明，一种高亲和力抗体具有如下特征的亲和力：

(ⅰ)在抗原包被的微量滴定板的孔内温育第一种和第二种抗体样品，其浓度选择在标准曲线的线性反应部分之中，pH7.2,37℃,1小时；

(ⅱ)从两种样品中去除未结合的抗体；

(ⅲ)将第一种样品与PBS在pH7.2,37℃条件下温育1小时，并将第二种样品的pH值降至pH3或更低后37℃温育1小时；

(ⅳ)去除两种样品中未结合的抗体；

(ⅴ)将两种样品与抗抗体碱性磷酸酶偶联物在37℃温育1小时；

(ⅵ)去除两种样品中未结合的偶联物；以及

(ⅶ)向样品中加入PNPP底物，测定样品在405nm的光吸收值，以确定与抗原结合的抗体量，其中第二种样品的结合量大于50％的第一种样品的结合量。

优选地，步骤(ⅲ)中最大pH值为2.5，更优选为2.0。

预计具有酸耐受性的抗体或抗体片段更有利于结合而非解离，因而它们在靶位点具有更长的定居时间，导致更高的定居于靶位点的抗体浓度。

特别地，本发明涉及一种高亲和力单链Fv抗体片段的生产。这种ScFv具有特别的优点，它可允许其在体内更好地靶定位点。

附图描述

图1表明了在多种pH值下具有对癌胚抗原亲和力的绵羊和小鼠单克隆抗体以及单链Fv的酸耐受性结果。

发明描述

可以使用多种技术获得根据本发明的酸耐受性单克隆抗体。例如，可以使用经典的杂交瘤技术，包括分泌高亲和力抗体的免疫动物的B淋巴细胞与另一种适宜的融合伴侣的融合。另外一种可选择的方法为纯化所挑选的淋巴细胞的mRNA，并使用PCR技术扩增所需要的抗体基因。噬茵体展示技术和其它用于抗体片段展示的技术也可以用来在适当的筛选过程之后从原始文库或免疫文库中获得抗体基因。

抗体基因可以同毒素、放射性同位素、酶或其它任何合乎需要的分子共表达或化学交联，以提供具有强结合特点的融合蛋白。进一步，抗体可通过US-A-5770429所述的方法由转基因动物进行生产。

抗体可以是包括重链和轻链以及恒定区和可变区的完整抗体。另外可选择地，抗体可以是抗体片段，例如F(ab′)₂、Fab、Fv或单链Fv片段，只要包含了赋予“酸耐受性”的可变区的至少一部分。抗体也可以是动物抗体、嵌合抗体或人源化抗体。专利WO-A-92/15699中公开了一种生产人源化抗体的适当方法。

在本发明一个优选的实施方案中，抗体为单链Fv片段。单链Fv片段包含由一适宜的肽连接的重链和轻链的可变区。

本发明的抗体可以由其酸耐受性定义，其可由如上所述的酸洗的酶联免疫吸附实验(EIA)表征。一般，与pH7.2条件下样品由EIA获得的A₄₀₅值相比较，pH3或更低pH值条件下样品的A₄₀₅值将代表＞50％的抗体结合。优选地，样品在pH2条件下的A₄₀₅值将代表＞60％，更优选地为70％的pH7.2条件下获得的抗体结合。

经受免疫接种的动物不是啮齿类，而是选择可产生更高亲和力抗体的动物。可以使用任何大型哺乳类动物，且适宜的动物包括兔子、山羊、母牛和绵羊。

本发明的抗体可用于治疗，并且可以与生理可接受的赋形剂、稀释剂或载体一起配制入任何适当的组合物。

以下实施例阐明了本发明。

实施例1

用完全福氏佐剂中的癌胚抗原(CEA)免疫绵羊，然后用不完全福氏佐剂中的抗原加强免疫三次。在末次加强免疫之后处死动物并取出淋巴结。