[发明专利]一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用。属于生物技术领域。通过去除人源C1GALT1的转移酶膜结合结构域,得到改造蛋白C1GalT1‑1。糖结合实验显示，原核表达的C1GalT1‑1突变体保持了结合O‑GalNAc类型修饰，对其他糖基化修饰并不结合。单糖封闭实验显示，经过GalNAc单糖孵育后，C1GalT1的活性完全被抑制，因此本发明改造蛋白在识别和大规模鉴定O‑GalNAc糖基化修饰具有更大的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物科技技术领域，涉及一种改造的人源糖基转移酶、制备方法及应用。

背景技术

糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工实现其生物学功能。目前已经发现了超过上百种糖基转移酶，合成了超过7000种复杂的糖结构，细胞内大部分蛋白都会被糖基化修饰，现在已经发现糖基化修饰参与各种生物过程，调控基本生理活动。

O-GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)修饰是大多数O-连接糖基化修饰(除去O-GlcNAc(N-乙酰葡萄糖胺)修饰)的第一步修饰，主要发生在高尔基体内，有20多种糖基转移酶可以完成这一步，通过糖基转移酶ppGalNAc-Ts将底物UDP-GalNAc共价连接到蛋白的丝氨酸或苏氨酸上，首次发现于1969年。正常生理情况下，O-连接糖基化一般会继续延伸，通过半乳糖糖基转移酶C1GalT1在GalNAc单糖后面添加一个半乳糖。但是C1GalT1并不能单独完成加糖过程，必须其专门的分子伴侣Cosmc帮助下可以在O-GalNAc修饰后面转移一个半乳糖。O-GalNAc修饰之前一直被认为合成起始于高尔基体中，大部分分泌到细胞外，有部分存在于肿瘤细胞的表面，特别是一些mucin类型的糖蛋。但是最近有文章报道，在细胞核中同样发现了大量的O-GalNAc修饰的信号，并且在细胞核中成功鉴定到了ppGalNAc-T3糖基转移酶。

传统的观点认为O-GalNAc修饰主要发生分泌途径中，主要修饰的靶蛋白为分泌蛋白和膜蛋白。因此O-GalNAc修饰的功能研究目前主要集中膜蛋白和一些体液例如血清中的糖蛋白的功能，因为和肿瘤密切相关，O-GalNAc修饰也叫肿瘤相关抗原即Tn抗原。目前已经有几种Tn抗原阳性的糖蛋白例如黏蛋白CA15-3(MUC1)和CA125(MUC16)在临床上已经用于多种恶性肿瘤的诊断和预后跟踪，例如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和卵巢癌等，Tn抗原表达的上升一般预示着肿瘤恶性程度的增加和预后不良。在乳腺癌中，高表达的Tn抗原可以通过招募Galectin-3和MUC1使肿瘤细胞能够吸附在内皮细胞上，从而促进了肿瘤细胞的转移。然而Tn抗原在肿瘤发展中到底扮演着什么样的角色，目前仍然不是很清楚。

目前已经有很多工具用于去识别O-GalNAc修饰，其中凝集素仍然是广泛用于检测和结合O-GalNAc修饰的工具，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA和Ricin等，这些凝集素大多来源于植物和真菌。这些报道识别O-GalNAc修饰的凝集素都是由二聚体或者四聚体通过非共价连接，特异性不专一，会结合其他的单糖例如galactose末端糖结构。综合而言，目前并没有一个对O-GalNAc修饰十分特异的凝集素，识别工具的缺乏也导致了对O-GalNAc修饰的研究十分困难。

除了凝集素外，有课题组发现糖加工的酶也有结合糖蛋白的能力，通过敲除酶的催化活性位点，让其保留对糖结合的能力，从而用于去识别糖基化修饰。例如有文章对来源于细菌的O-GlcNAc糖苷水解酶CpOGA进行改造，突变了其催化活性位点，结果显示改造后的CpOGA失去了切除O-GlcNAc修饰的活性，但是保留了结合O-GlcNAc修饰的糖结合活性，改造后的CpOGA已经在很多复杂样品对O-GlcNAc修饰都有很好的富集效果。鉴于CpOGA改造的成功，为了研发识别O-GalNAc修饰的识别工具，很有必要对O-GlcNAc修饰延伸的糖基转移酶C1GalT1进行改造，从而筛选出对O-GalNAc修饰的特异性结合的工具，推动O-GalNAc修饰的功能研究。

发明内容