[发明专利]用于检测单碱基突变位点的引物和探针及检测方法

说明书

本发明提供一种用于检测单碱基突变位点的引物和探针及检测方法。本发明提供的单碱基突变位点检测方法，当模板为野生型时，阻遏引物在与正向引物竞争结合模板时会更有优势，随着反应的进行，由阻遏引物与反向引物产生的扩增产物越来越多，同时反应体系中的反向引物越来越少，进一步阻遏正向引物的工作，由于阻遏引物与反向引物的扩增子不包含与探针的互补序列，因此不产生荧光信号。本发明的引物探针设计方法与现有方法相比，在检测单碱基突变位点时具有更高的特异性，即在检测野生型靶核酸序列时，假阳性情况会更小，更有利于突变型的检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于检测单碱基突变位点的引物和探针及检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)是一般不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、亲子鉴定等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(RealTime Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。

目前现有的单碱基突变位点检测试剂，多采用TaqMan竞争探针法或是扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。其中TaqMan探针的基本原理是利用扩增过程中Taq酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针延伸，当引物延伸至寡核苷酸探针结合位置时，Taq酶可以将其切割成小片段，使得荧光报告基团与淬灭基团分开，从而发出荧光。将其应用于单碱基突变位点检测中，通常会采用两条竞争性探针，一条针对突变型的靶核酸序列，另一条针对野生型的靶核酸序列。然而，传统的Taqman探针用于检测时往往存在交叉反应的问题，在点突变检测中，野生型与突变型仅仅只有一个碱基的差异，探针的交叉反应容易影响检测试剂的特异性，造成假阴性或假阳性结果。

另一方面，ARMS利用DNA聚合酶缺乏3’外切酶活性的特点，如果引物的3’末端碱基不能与靶核酸序列正确的互补配对，那么靶核酸序列就不能被有效的扩增。但在进行单碱基突变位点的检测时，普通ARMS引物往往无法阻滞非特异性的模板扩增，在检测时容易产生假阳性的结果，因此导致检测的特异性不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测单碱基突变位点的引物和探针及检测方法。

本发明的基本技术原理是ARMS技术，对普通ARMS技术进行了改良。普通ARMS技术所设计的引物存在较大概率错配，容易产生非特异扩增。目前提高ARMS技术特异性的方法除了在3′端人为引入一个错配碱基提高与野生型模板的错配外，还有在此基础上增加一条与野生型模板互补的封闭引物，其特征是3′端通过特殊修饰使得引物无法进行延伸(由于探针在上下游引物之间，如果封闭引物延伸，则会水解探针产生信号)，通过封闭引物与突变引物竞争结合野生模板来提高在检测野生模板时的特异性。但是这种方法的不足之处是：当突变型引物与野生型模板错配产生非特异扩增后，扩增产物序列与突变型引物完全匹配，在下一个PCR循环中，该扩增产物作为模板将优先结合突变型引物，而非封闭引物。随着PCR反应的进行，与突变型引物互补的扩增产物越来越多，而野生型模板的总数不变，突变型引物将逐渐占据优势，最终产生扩增信号，出现假阳性。