[发明专利]CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用，所述的基因编辑系统包括特异性靶向Myo6supgt;C442Y/supgt;突变基因的gRNA以及SaCas9‑KKH，并通过AAV‑PHP.eB病毒载体递送，形成了有效的针对Myo6supgt;C442Y/supgt;的敲除系统。本发明通过Myo6supgt;WT/C442Y/supgt;小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2系统能特异性地敲除Myo6supgt;WT/C442Y/supgt;小鼠中的Myo6supgt;C442Y/supgt;突变等位基因，且Myo6supgt;WT/C442Y/supgt;小鼠中注射AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2后可在长达5个月的时间内，观察到听觉功能的恢复，同时，还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，直观地验证了AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2系统对Myo6supgt;C442Y/supgt;突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用，可用于制备治疗半显性遗传感音神经性聋的药物。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用。

背景技术

肌球蛋白VI(Myosin VI，MYO VI)是一种非常规肌球蛋白，在内耳的内外毛细胞均有表达，特别是纤毛的表皮板，因此认为该蛋白对于纤毛在表皮板的锚定发挥重要作用。MYO6基因的致病变异导致常染色体显性遗传非综合征性听力丧失或常染色体隐性遗传性非综合征性听力丧失。对日本听力损失患者进行的大规模遗传分析发现，2.4％的常染色体显性遗传感音神经性耳聋病例是由MYO6突变引起的。肌球蛋白VI p.C442Y突变在人类引起在儿童时期开始发生进行性听力损失，到5岁时表现出严重的感音神经性聋。虽然MYO6突变在遗传性耳聋中发挥重要作用，但目前尚缺乏有效的治疗和预防方法。

腺相关病毒(AAV)介导的基因过表达治疗在隐性小鼠耳聋模型的多项临床前试验已报道成功地治疗了听力损伤。然而，这种策略的缺点是其有效期短，非靶细胞的过量蛋白表达造成未知风险，且缺乏控制基因表达的元件，这种疗法不适合于像肌球蛋白VIp.C442Y那样的半显性遗传突变。

因此，我们亟需寻找一种有效针对Myo6^C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗方法。

发明内容

本发明针对缺乏治疗Myo6^C442Y突变基因导致的耳聋的问题，目的在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，用以特异性靶向并敲除Myo6^C442Y突变基因，保留野生型链使Myo6^WT基因发挥正常功能，从而治疗由Myo6^C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋，可制备治疗遗传性感音神经性聋的药物。

基于上述，本发明首先提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6^C442Y突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6^C442Y突变基因的gRNA。

优选地，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述的Cas9为SaCas9-KKH。

优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。

进一步地，所述的腺相关病毒为AAV-PHP.eB病毒。

本发明还提供了所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用；所述的遗传性感音神经性聋为Myo6^C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋。