[发明专利]一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法及应用

说明书

一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法及应用，p54‑H22细胞作为免疫原和p54‑293T细胞作为检测原，所述的p54‑H22细胞用的实验物为雌性Balb/c小鼠，所述的雌性Balb/c小鼠三免一周后采用IPMA方法测定，融合后的细胞的培养基与p54‑293T细胞做IPMA检测筛选阳性杂交瘤细胞株，经三次亚克隆后获得了10株能够稳定分泌抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用p54‑H22细胞的雌性Balb/c小鼠制备单抗。采用以上结构后，本发明具有如下优点：1、本实验中，用全细胞免疫小鼠，小鼠的IPMA效价达到较高水平，筛选到的抗体特异性高，杂交瘤筛选效果也较明显；2、小鼠血清IPMA效价可达1:25600，细胞融合后，最终通过IPMA法筛选出10株单克隆抗体，多株单克隆抗体使得实验数据更加准确可靠。

技术领域

本发明涉及克隆抗体技术领域，具体是指一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高率，可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血。我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视(孙怀昌.中国预防兽医学报，1999，21(2)：117～119)。

本病自1921年在肯尼亚发现以来，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，单在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行，截至目前已在非洲、欧洲和美洲等数十个国家流行，而且有不断蔓延趋势。2007年，亚美尼亚连续发生六起非洲猪瘟，我国尚无该病。

非洲猪瘟在国际病毒分类委员会第四次报告中归于虹彩病毒科，在该委员会第五次报告中将其列在痘病毒科之下，置于该科的脊椎动物痘病毒亚科及昆虫痘病毒亚科之外。但DNA序列分析表明，ASF病毒具有介于痘病毒和虹彩病毒之间的特征，ASFV的这一特性表明它不属于国际病毒分类委员会所核定的任何一科，是个新科，1995年第9次国际病毒分类委员第六次报告，将非洲猪瘟病毒列入“类非洲猪瘟病毒属”，非洲猪瘟是唯一已知的代表种。

目前尚无有效的疫苗，因此通过快速诊断非洲猪瘟抗体水平来判断猪只的感染情况，从而制定有效的控制和消灭措施，进而及时准确的诊断检测和严格有效的封锁扑杀等措施是成功消灭非洲猪瘟的有效方法。非洲猪瘟抗体诊断方法包括琼脂扩散试验、ELISA、免疫印迹、免疫荧光等。目前，我国诊断非洲猪瘟的检测试剂主要依赖进口，拥有自主知识产权的方法和试剂很少，加之周边国家严峻的疫情形势，我国迫切需要建立自己的检测方法和试剂。

发明内容

本申请的目的是提供一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

一种抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法，p54-H22细胞作为免疫原和p54-293T细胞作为检测原，所述的p54-H22细胞用的实验物为雌性Balb/c小鼠，所述的雌性Balb/c小鼠三免一周后采用IPMA方法测定，所述的雌性Balb/c小鼠血清效价可达1:25600，无菌操作取出效价较高雌性Balb/c小鼠的脾脏，研磨成单细胞后在聚乙二醇(PEG)的作用下与SP2/0细胞融合，融合后的细胞的培养基与p54-293T细胞做IPMA检测筛选阳性杂交瘤细胞株，经三次亚克隆后获得了10株能够稳定分泌抗ASFV p54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用p54-H22细胞的雌性Balb/c小鼠制备单抗，常用试剂包括RPMI-1640基础培养基、RPMI-1640完全培养基、HAT培养基、GNK洗液和细胞冻存液。

采用以上结构后，本发明具有如下优点：

1、本实验中，用全细胞免疫小鼠，小鼠的IPMA效价达到较高水平，筛选到的抗体特异性高，杂交瘤筛选效果也较明显；