[发明专利]检测细胞凋亡的BRET活体成像探针

说明书

本发明公开检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，用于活体水平对细胞凋亡进行评估，通过将Annex i n V与生物发光共振能量转移BRET的mNeonGreen‑teLuc融合蛋白结合起来，构建出AnVPb这种高灵敏、低背景的凋亡生物传感器，实现同时对细胞凋亡进行荧光和生物发光的检测。本发明既可以应用于常规基于荧光的体外细胞凋亡检测，又可用于活体深部组织的生物发光成像，对体内凋亡细胞进行追踪。本发明活体成像探针通过一系列的活体成像结果证实了AnVPb具有跟踪病灶，尤其是在深层组织中具有良好的发光表现，实现病灶损伤的评估；本发明活体成像探针灵敏度高，价格低廉、易于操作，不易受检测样本种类的限制。

技术领域

本发明涉及生物发光活体成像领域，具体是检测细胞凋亡的BRET活体成像探针。

背景技术

细胞凋亡又称为细胞程序性死亡，是正常组织发育和疾病发生中的重要生物过程。研发新的细胞凋亡检测技术一直是活跃的科研领域之一。Annexin V是一种36kDa的磷脂结合蛋白，其能够在较高浓度的Ca²⁺存在下与带负电荷的磷脂如磷脂酰丝氨酸(PS)结合。在正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧。而当细胞凋亡发生时，即使在早期，PS也会从细胞质膜内叶外翻到细胞表面。因此，Annexin V常被作为细胞凋亡早期事件的标志物应用于多种凋亡检测技术中。

近年来，以非侵入性成像的方法对细胞凋亡进行可视化检测在基础研究中已被广泛应用，并有望为以细胞凋亡为主要特征的人类相关疾病的诊断提供快捷的方法。基于Annexin V的特异性显像剂已经成功地应用于各种疾病模型的研究和临床水平的诊断，其中包括癌症、心肌梗死和缺血以及动脉粥样硬化等。远红外荧光染料偶联的Annexin V探针也被开发用于实验动物活体检测，但荧光染料本身需要激发光，且动物体的自发荧光会增加成像的背景信号。因此，开发更好的Annexin V探针分子就显得尤为重要。

近年来，针对以荧光素酶为代表的生物发光探针的研究越来越深入。生物发光具有背景信号几乎为零、信噪比高、比荧光更灵敏等优点。因此，开发高灵敏、强信号的生物发光探针是将生物发光应用于活体成像领域的先决条件。

目前，生物发光系统已被广泛应用于生物医学领域，从超敏感生物测定、药物筛选再到高灵敏度的生物发光成像(Bioluminescence imaging，BLI)都有生物发光蛋白的参与。传统的生物发光蛋白系统主要是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，FLuc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)。然而，这些荧光素酶的适用性往往受到其大小、稳定性和发光效率的限制。因此，开发穿透能力更强的生物报告分子是解决以上问题的必要条件。

发明内容

本发明的目的在于提供检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，通过构建检测早期细胞凋亡的探针质粒AnVPb及对照探针mAnVPb，通过原核表达载体纯化该探针蛋白，并对探针BRET性能进行检测，将该探针用于体外和体内实验；体外实验中，用过氧化氢处理A172细胞建立氧化应激诱导的细胞凋亡模型，用探针蛋白对处理后细胞进行染色评估早期细胞凋亡；体内实验中，分别在小鼠急性肾损伤模型和脑卒中模型中用AnVPb结合活体成像技术评估病灶区细胞的凋亡情况进而跟踪病灶的发展，并且在脑卒中模型中用作评估脑卒中具有神经保护作用Serpina3蛋白的干预效果。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，根据BRET的原理，构建在原核表达体系里表达的凋亡探针AnVPb和对照探针mAnVPb质粒，分别在大肠杆菌中表达，并用Ni-NTA进行亲和纯化得到凋亡探针和对照探针蛋白，对纯化后的凋亡探针AnVPb和对照探针mAnVPb进行荧光激发光谱和发射光谱测定。

所述AnVPb凋亡探针质粒通过将Annexin V分别与绿色荧光蛋白mNeonGreen和荧光素酶teLuc相融合插入pET28Zs载体中获得。