[发明专利]检测细胞凋亡的BRET活体成像探针

权利要求书

1.检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，其特征在于，根据BRET的原理，构建在原核表达体系里表达的凋亡探针AnVPb和对照探针mAnVPb质粒，分别在大肠杆菌中表达，并用Ni-NTA进行亲和纯化得到凋亡探针和对照探针蛋白，对纯化后的凋亡探针AnVPb和对照探针mAnVPb进行荧光激发光谱和发射光谱测定；

所述AnVPb凋亡探针质粒通过将Annexin V分别与绿色荧光蛋白mNeonGreen和荧光素酶teLuc相融合插入pET28Zs载体中获得；

所述mAnVPb对照探针质粒通过将带有突变位点的突变型Annexin V分别与绿色荧光蛋白mNeonGreen和荧光素酶teLuc相融合插入pET28Zs载体中获得。

2.根据权利要求1所述的检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，其特征在于，对体外细胞培养水平，通过用过氧化氢处理A172细胞建立氧化应激诱导的细胞凋亡模型，用探针蛋白对处理后凋亡细胞的特异性结合能力进行特异性标记来评估早期细胞凋亡；对体内活体水平，活体成像探针AnVPb结合活体成像技术，用作在体评估活体动物病灶区细胞的凋亡情况和跟踪病灶的发展。

3.根据权利要求1所述的检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，其特征在于，所述AnVPb构建了用于实验对照的对照探针mAnVPb，突变型Annexin V包括四个突变位点，分别为E72Q、D144N、E228Q和D303N。

4.根据权利要求1所述的检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，其特征在于，所述AnVPb和mAnVPb均采用NLuc变体的设计思路，将mNeonGreen与teLuc相偶联。

5.根据权利要求1所述的检测细胞凋亡的BRET活体成像探针，其特征在于，所述活体成像探针的构建和性能测试包括以下步骤：

S1、Annexin V探针蛋白表达质粒的构建，蛋白探针的原核表达与纯化；

S2、Annexin V探针BRET性能测定及浓度依赖性活性检测；

S3、Annexin V探针蛋白对体外细胞氧化应激损伤中早期细胞凋亡的检测；

S4、Annexin V探针蛋白在活体水平对细胞凋亡相关疾病模型的评估-模型Ⅰ：急性肾损伤模型；

S5、Annexin V探针蛋白在活体水平对细胞凋亡相关疾病模型的评估---模型Ⅱ：脑卒中模型；

S6、Annexin V探针蛋白在活体水平跟踪脑卒中病灶演变情况；

所述步骤S1操作如下：

S11、Annexin V探针蛋白原核表达载体的设计

S111、改造pET28a获得高效表达载体pET28Zs；

S112、将mNeonGreen与teLuc相偶联；

S113、对Annexin V进行优化；

S114、在融合蛋白中引入HA标签，蛋白之间用Gly-Gly-Gly-Gly-Ser连接；

S115、插入pET28Zs载体，获得AnVPb探针和对照探针mAnVPb；

S12、Annexin V探针mAnVPb蛋白的诱导表达；

S13、Annexin V探针蛋白的纯化；

S14、分析蛋白质的浓度和纯度；

所述步骤S2的操作如下：

S21、探针蛋白荧光光谱的测定；

S22、探针蛋白生物发光光谱的测定；

S23、浓度依赖的探针蛋白的催化活性测定；

所述步骤S3的操作如下：

S31、A172细胞培养；

S32、氧化应激模型的建立及早期细胞凋亡的检测；

所述步骤S4的操作如下：

S41单侧肾损伤模型；

S42、探针注射；

S43、活体成像；

所述步骤S5的操作如下：

S51、脑表面光栓造模

采用脑皮层光栓造模，包括手术准备、麻醉小鼠、目标区照射、玫瑰红注射和伤口缝合；

S52、探针注射；

S53、活体成像；

S54、AnVPb生物发光信号衰减情况的体内表征；

所述步骤S6的操作如下：

S61、脑表面光栓造模；

S62、探针注射；

S63、活体成像。