[发明专利]一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法

说明书

本发明公开了一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法，该方法的核心发明点是在多聚甲醛固定前先常温干燥6～12小时。本发明改进方法在NETs的验证实验中，能帮助排除因多聚甲醛固定导致的假阳性，且能明显减少实验过程中细胞被洗掉的风险，有利于中性粒细胞的NETs的相关实验的开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法。

背景技术

中性粒细胞是先天免疫系统的主要效应细胞之一，具有多种免疫功能，如吞噬、脱颗粒、产生活性氧类以及形成和释放中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellulartraps，NETs)。 NETs是以解聚的DNA为骨架，并与中性粒细胞颗粒蛋白组成的网状结构。NETs的产生受到多种诱导因素的影响，如豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。

NETs与多种疾病的发病和治疗存在密切关联，表现为“双刃剑”作用。一方面它既能在感染性疾病中防止病原微生物的扩散和起杀灭作用，如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌和呼吸道合胞体病毒等；另一方面NETs是引起部分免疫性疾病的发病因素，如小血管炎、系统性红斑狼疮等自身免疫缺陷性疾病。因此，准确、可靠地对中性粒细胞NETs 进行检测是非常重要的实验技术。

免疫荧光试验是用特异性抗体与标本中相应抗原反应后，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与之结合，然后在荧光显微镜下观察实验结果。该方法具有诸多优点，因而被广泛应用于细胞生物学研究中。

但是，使用免疫荧光试验检测中性粒细胞NETs时，容易产生假阳性。这主要是因为在多聚甲醛固定步骤中，固定剂多聚甲醛容易诱导中性粒细胞产生NETs。这种现象导致科研人员在该实验中，为了更好地呈现对照组(理应不产生NETs)结果时，在荧光显微镜下挑选符合要求的视野，避免选择产生NETs的视野。这显然有违实验原则。

为了克服现有技术存在的缺陷，特提出本发明。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种改进的中性粒细胞NETs免疫荧光检测方法，在多聚甲醛固定前先常温干燥6～12小时。在具体实施例中，图3～4与图1～2相比，未刺激组(PMA-)没有观察到任何NETs现象，说明在使用本发明改进方法观察中性粒细胞NETs现象时，不会产生假阳性。而且，值得说明的是，虽然改进方法与传统方法相比仅仅是延长了第5步多聚甲醛固定前的常温干燥时间，但是却将未刺激组的NETs完全消除，这种改进不是缓解了现有技术的不足，而是彻底消除了现有技术的不足，这种量变已经达到质变。而且，将图1～2与图3～4对比可以发现，传统方法刺激组和未刺激组的细胞密度均明显少于改进方法，改进方法细胞密度适中，便于实验观察。同时，需要说明的是，目前仅发现固定剂多聚甲醛会诱导中性粒细胞产生NETs，尚未在其他细胞中发现这种现象。因此，本发明改进方法存在特定的使用对象，解决特定对象的特定不足。

优选地，所述的免疫荧光检测方法包括如下步骤：

步骤S1、提取中性粒细胞，并调整中性粒细胞浓度；

步骤S2、将中性粒细胞加入细胞培养板内，给予或不给予中性粒细胞NETs刺激剂，37℃细胞培养箱孵育；

步骤S3、收集细胞进行甩片机离心；

步骤S4、甩完片后，取出甩完片的细胞黏附片子；

步骤S5、常温干燥6～12h后，多聚甲醛常温固定，Triton透化，BSA常温封闭，T-PBS洗涤；孵育一抗，T-PBS洗涤，常温孵育二抗，DAPI染核封片荧光镜下观察。

有益效果：