[发明专利]人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定和应用

说明书

本发明涉及人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用及分泌蛋白POSTN的鉴定方法，鉴定方法的步骤为人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取；质谱分析条件培养基中羊膜间充质干细胞外分泌蛋白，筛选出高表达蛋白POSTN。本发明鉴定了羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，筛选出精原干细胞增殖积极因子POSTN，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。POSTN为精原干细胞体外增殖提供了新的细胞因子，为更好的挖掘羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白-骨膜蛋白(periostin，POSTN)的鉴定和应用。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）已被证明能够分泌各种自分泌/旁分泌因子，包括生长因子和细胞因子，这些因子在细胞治疗过程中起很大作用。人羊膜在分娩后常被当作生物废物丢弃，成为羊膜间充质干细胞（hAMSCs）的重要来源。此外，它还有许多其他优点，如抗炎、抗菌、抗血管生成特性和低免疫原性。HAMSC分泌因子用于急性脑损伤的无细胞治疗。我们在hAMSCs条件培养基（hAMSCs-CM）中发现了许多与细胞增殖有关的蛋白质。

骨膜蛋白(periostin, POSTN)是一种由836个氨基酸组成、大小约90kD的细胞外基质蛋白。POSTN在体内广泛表达，在主动脉、胃、下消化道、胎盘、子宫、甲状腺组织和乳腺中水平最高。它主要在个体发育过程中和成人结缔组织暴露于机械负荷时产生，如心脏瓣膜、皮肤、牙周韧带、肌腱和骨骼。此外，POSTN在受伤后的愈合过程中也起着关键作用。POSTN有两种作用途径，一种是通过与细胞外基质成分相互作用来驱动胶原纤维形成和重塑，另外一种是通过细胞表面整合素受体传递信号来促进细胞粘附、迁移和增殖。目前并没有在人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白中鉴定出POSTN，也未见相关的鉴定方法报道，同时对POSTN的应用研究尚未深入，对于人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN与精原干细胞增殖作用的关系及在临床上男性不育的治疗及男性生育力保存作用方面的研究未见报道。

发明内容

发明目的：本发明提出一种人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定和应用，其目的在于提出一种从羊膜间充质干细胞外分泌蛋白中鉴定出POSTN的方法，并验证该蛋白有促进精原干细胞增殖的作用。

技术方案：

人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN在制备促进精原干细胞增殖制品中的应用。

所述制品为药品、保健品和食品。

一种人羊膜间充质干细胞外分泌蛋白POSTN的鉴定方法，步骤为：

1）人羊膜间充质干细胞条件培养基的收取：在产妇的羊膜组织中提取人羊膜间充质干细胞，对提取的羊膜间充质干细胞进行流式细胞检测；满足阳性率条件后，人羊膜间充质干细胞进行成骨、成脂分化诱导：获得诱导后的人羊膜间充质干细胞；对诱导后的羊膜间充质干细胞采用条件培养基培养，收集条件培养基；

2）质谱分析条件培养基中羊膜间充质干细胞外分泌蛋白，筛选出高表达蛋白POSTN。

流式细胞检测方法为：将羊膜间充质干细胞在PBS中洗涤2-4次，羊膜间充质细胞悬浮液与FITC-CD73，CD44，CD29，HLA-DR，CD31，CD45的荧光抗体在避光常温孵育20-40分钟，然后PBS洗涤2-4次并重悬，上机测定抗原的阳性率。

条件培养基培养方法为：诱导后的人羊膜间充质干细胞培养第二代融合度为80%-90%时传代，分别以2×10⁶-2×10⁸个细胞种至75cm²培养瓶中，24-48小时后用PBS洗2-4次，将培养基换成无血清培养基，24小时收集无血清培养基，-80℃冰箱保存。

本发明的有益效果及特点：