[发明专利]基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法及应用

权利要求书

1.基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1样本处理：采集血清样本和/或组织样本，并进行相应处理，

血清样本处理，在手术切除前收集喉癌血清样本，并在- 80℃条件下保存用于脂质组学分析，冷冻血清样品经解冻，涡旋均质，添加脂质内标化合物离心分离取上层有机相干燥后储存在- 80℃；

 组织样本处理，组织样本称重，添加脂质内标化合物均质，离心分离取上层有机相干燥后储存在- 80℃；

所述脂质内标化合物为PC(19:0/19:0)、PE (17:0/17:0), LPC (19:0), SM (d18:1/12:0), TG (15:0/15:0/15:0), Cer (d18:1/17:0)和FFA (16-d3)；

S2脂质组学分析：脂质组采用超高效液相色谱结合三重TOF 5600 Plus质谱仪系统进行分析,分析前，冻干样品在CH₂Cl₂-MeOH溶液中按2:1 v/v比重组，然后在含有ACN-MeOH-H₂O的混合溶剂中稀释，混合溶剂中ACN：MeOH：H₂O体积比为65:30:5 v/v/v；随后使用C8ACQUITYTM柱，100×2.1毫米,1.7µm，将5µL的稀释样本分开；

柱温60℃，洗脱速率0.3 mL/min;

流动相A、B分别为ACN:H2O 6:4 v/v、异丙醇IPA: ACN 9:1 v/v，均含10 mM乙酸铵；

最初的洗脱梯度从50%B开始,维持1.5分钟；其次是在9.0分钟内线性增加到85% B ,然后在0.1分钟内达到100% B,维持1.9分钟；最后,在0.1分钟内返回50% B,维持1.9分钟使柱平衡；

质谱信号扫描在正离子和负离子模式下从m/z范围200-1250道尔顿，正离子和负离子模式下的毛细管电压分别设置为5.5 kV和- 4.5 kV，正离子和负离子模式的界面加热器温度分别设置为500℃和550℃；

S3数据处理和统计分析：脂质的定量检测利用MultiQuant™2.1 ，AB SCIEX,Concord, Canada进行操作，质量宽度为±0.05 Da, tR宽度为±0.25 min，所有脂质组学数据均按照相应的脂质内标进行标准化；

使用SIMCA-P软件进行监督式偏最小二乘判别分析，采用Pareto标度模式，该模式将每个变量除以标准差的平方根，以抑制噪声干扰；

喉癌组与正常对照组之间的比较采用Wilcoxon非参数检验，Mann-Whitney检验模式，以识别显著差异的脂质p  0.01  FDR  0.05；

热图由开源软件MultiExperiment Viewer制作；

使用SPSS软件version 19 进行二元logistic回归的受试者工作特征曲线；

有显著脂类变化的柱状图由GraphPad Prism软件制作。

2.根据权利要求1所述的基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法，其特征在于，所述S1样本处理：包括7种脂质内标化合物的冷甲醇分别添加到血清样本和/或组织样本中。

3.根据权利要求1或2所述的基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法的应用，其特征在于，所述基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法应用于血清样本和/或组织样本筛查。

4.根据权利要求3所述的基于神经酰胺、鞘磷脂和富含花生四烯酸酰基链的磷脂的喉癌分析方法的应用，其特征在于，从所述血清样本中筛查Cer、CerG1、SM、PC、PC- o、PE、PI、PS、ChE的相对水平明显增加样本； LPC、LPC- o、LPE、LPE-p、DG水平明显降低样本。