[发明专利]基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用

说明书

本发明提供了一种基于金‑石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用，该电化学生物传感器的制备方法包括：称取原料一水合柠檬酸、组氨酸和色氨酸加入去离子水得到反应液，将反应液放入烘箱内反应，反应结束后得到组氨酸和色氨酸功能化石墨烯量子点，其作为稳定剂和还原剂与氯金酸溶液一步法反应合成金‑组氨酸和色氨酸石墨烯杂合物，基于该杂合材料构建了无酶循环扩增电化学DNA传感器；本发明的电化学生物传感器通过发夹自组装，通过金/石墨烯量子点和无酶循环扩增的双重信号放大策略，使得该电化学传感器检测循环DNA具有超高的灵敏度，达到检测限低至亚皮摩尔水平；同时其检测重复性好，稳定性优良。

技术领域

本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用。

背景技术

循环肿瘤DNA（ctDNA）是随细胞凋亡、坏死而释放到外周血、脑脊液等体液中的，由肿瘤原发灶或循环肿瘤细胞衍生的单链或双链DNA片段。多项研究表明，ctDNA作为一种极具临床应用前景的肿瘤生物标记物，在肿瘤评估等方面备受关注。例如，KRAS基因点突变与包括肺癌、结直肠癌和卵巢癌等在内的多种癌症密切相关。因此，ctDNA的定量分析在肿瘤的早期诊断、病程进展和预后监测等方面发挥着至关重要的作用。然而，ctDNA定量检测面临的最大挑战是体液中的ctDNA含量极低，需要极高的灵敏度才能实现定量分析与检测。

目前，ctDNA的分析方法主要有无酶PCR反应、DNA测序、基因芯片和酶辅助的PCR扩增，这些技术相对成熟，却仍然存在诸多不足。基于无酶PCR的技术，如数字PCR和微滴式数字PCR （ddPCR），已成功应用于ctDNA检测，却易被化学物质影响而产生假阴性或假阳性。DNA测序是检测基因突变的金标准技术，但具有仪器设备昂贵、耗时长等不可避免的缺点。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。但是，该技术成本昂贵、复杂，检测灵敏度较低，重复性差，分析泛围较狭窄。为了提高检测灵敏度，各种酶辅助信号扩增方法包括滚环扩增（RCA）、解旋酶依赖性扩增（HDA）和指数扩增反应已被用来克服标准PCR技术的局限性，在这些策略中使用酶可以显著提高检测灵敏度，但是，它可能会导致非特异性和假阳性信号，同时酶又是很昂贵的，并且控制反应条件以确保最佳的酶活性是具有挑战性的。因此，亟需发展一种经济实用、简单快速、灵敏度高的ctDNA分析方法以适应临床诊断治疗需要。

电化学DNA传感器因其具有高灵敏度、高特异性、低成本和良好便携性等独特优点吸引了国内外研究者的广泛兴趣，已经成为包括临床诊断、微生物检测和环境监测等许多重要领域的定量分析工具。在经典核酸传感器中，生物识别过程涉及互补核酸链碱基之间的非共价相互作用，表现为捕获探针和互补靶标序列之间的杂交。固定化核酸可以是茎环探针（SLP），也可以是线形探针（LP）。 对于典型电化学DNA生物传感器的构建，一般将DNA识别探针固定在电极上，通过特异性杂交捕获靶标DNA分子，随后传感器将相应变化转换成电化学信号。目前，对于肿瘤细胞中的标志物循环DNA的检测大部分都是采用基因芯片，PCR扩增的手段进行检测，而使用电化学DNA传感器的检测报道很少。

为了进一步提高电化学DNA生物传感器的灵敏度，近年来已使用了纳米材料，如中孔二氧化硅，金属纳米材料和石墨烯等。石墨烯量子点不仅继承了石墨烯的优点，而且具有独特的小粒径，丰富的边缘位点和各种官能团，对电解质离子有很强的吸附能力，因而在电化学领域展现出巨大的发展潜质。特殊功能化的石墨烯量子点还具有还原性，利用其作为还原剂与贵金属纳米粒子紧密结合。石墨烯量子点与贵金属的结合可以实现优势互补和相互协同。石墨烯量子点表面的疏水基团可以避免贵金属纳米粒子的聚集。不掺杂杂原子的石墨烯量子点的电活性显著下降，而贵金属纳米材料具有卓越的电导率和优异的电催化能力，两者结合后的复合材料不仅具有良好的电学性质，且具有良好的空间结构和形貌特征，能有效提高检测物的分析灵敏度。