[发明专利]基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中ctDNA中的应用

权利要求书

1.一种基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器在检测细胞中循环肿瘤DNA中的应用；

该基于金-石墨烯量子点的电化学生物传感器的制备方法包括如下步骤：

(1)、称取摩尔比3∶1∶2的柠檬酸、组氨酸和色氨酸混合，加入蒸馏水后超声10-30min溶解得到反应液，将所述反应液加热反应，得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点固体产物，并配制成水溶液，然后过滤2h得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液；

(2)、将2-20mL浓度为0.2-1mg/mL的氯金酸溶液在60-100℃下加热至沸腾，然后加入步骤(1)的所述组氨酸/色氨酸石墨烯量子点溶液中，离心，之后过滤得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物，清洗之后分散在三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，得到组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金储备液；

(3)、将三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、氯化钙、氯化钾和目标DNA反应得到DNA储备液，pH值为7.0-8.0；

(4)、将定制DNA的H2序列和定制DNA的H1序列分别溶解在步骤(3)的DNA储备液中，将溶解的H1序列和H2序列加热，并以1℃/min的速率冷却至室温，形成稳定的H1发夹结构和H2发夹结构；将硫堇加入步骤(3)的DNA储备液中，得到硫堇溶液；

(5)、将步骤(4)中H1发夹结构和H2发夹结构分别加入盐酸三-(2-羧乙基)膦溶液以激活发夹中的巯基基团，得到巯基基团活化的H1发夹溶液和H2发夹溶液；将所述H2发夹溶液与步骤(2)中的组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金储备液混合，得到第一混合液，将氯化钠和十二烷基硫酸钠依次加入所述第一混合液中，得到含有氯化钠和十二烷基硫酸钠的第二混合液，并将所述第二混合液孵育，然后离心，用步骤(3)的DNA储备液洗涤2-5次，去除未反应的物质，将收集的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物固体重新分散在步骤(3)中的DNA储备液中，最后将此溶液超声得到H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液；

(6)、将步骤(5)中H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液中，然后在空气浴振动器中孵育50-120min，得到活化的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液，将所述活化的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物溶液加入步骤(4)的硫堇溶液中，然后在空气浴振动器中孵育6-20h，之后离心收集，得到H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇固体，并用步骤(3)的DNA储备液洗涤2-5次，将清洗的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇固体再分散在步骤(3)的DNA储备液中，然后超声得到H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇原液；

(7)、将目标DNA和步骤(6)的H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇原液混合，得到目标DNA和H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇混合液；

(8)、将金电极用麂皮打磨，接下来用乙醇和超纯水清洗干净，然后用氮气吹干，在干净的金电极上滴加步骤(5)中的巯基基团活化的H1发夹溶液，37℃温育孵化30-80min，接着在电极上滴加6-巯基己-1-醇孵育30-80min，封闭电极上未反应的活性位点，孵育结束后用PBS缓冲液清洗电极并用氮气吹干得到适体传感器；

(9)、将步骤(7)中目标DNA和H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金-硫堇混合液滴加到适体传感器上，37℃温育孵化60min后，用磷酸缓冲液洗涤并用氮气干燥，得到基于金-石墨烯量子点复合材料的电化学生物传感器；

步骤(4)中，所述定制DNA的H1序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤(4)中，所述定制DNA的H2序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤(4)中，所述加热的温度为60℃，加热的时间为5min；

步骤(3)和步骤(7)中，所述目标DNA的序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(1)中，所述反应的温度为150-200℃，加热的时间为0.5-2h；

步骤(2)中，所述离心的转速为3000-10000rpm，离心的时间为5-30min；

步骤(5)中，所述孵育的温度为15-30℃，孵育的时间为6-48h；离心的转速为5000-16000rpm，离心的时间为5-30min；所述超声的时间为20-60s；

步骤(6)中，所述空气浴振动器的转速为150-500rpm，温度为15-37℃；离心的转速为5000-16000rpm，离心的时间为5-30min；所述超声的时间为20-60s；

步骤(7)中，所述混合的时间为10-30min；

步骤(5)中，所述H2-组氨酸/色氨酸石墨烯量子点-金杂合物固体和步骤(8)中制备的适体传感器在使用前需保存在2-8℃的冰箱中。