[发明专利]一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法

说明书

本发明公开了一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法。该方法首先对小麦叶片进行原生质体的提取，之后利用蔗糖密度梯度离心法对原生质体进一步纯化，得到近乎完整的原生质体；然后将原生质体破碎，叶绿体完整保留，通过离心进行分离获得完整的叶绿体和细胞质。本发明能有效的对叶绿体和细胞质进行分离，并且交叉污染较少，可进一步对细胞不同组分进行更深层的研究。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦原生质体、细胞质和叶绿体的分离方法。

背景技术

研究证明，杂交是产生生殖隔离的重要因素之一，是物种形成和分化的主要驱动力。杂交和多倍化均会造成不同亲本的核基因组融合在一起，但细胞质却仅来自某一亲本。因此，杂交和多倍体物种不仅要应对两套基因组融合的冲突，还要应对细胞核和细胞质中细胞器之间的兼容问题。例如，小麦、棉花、花生等多倍体作物，就是打破原有的的模式，重新建立了一种新的细胞核和细胞器共存的模式，而水稻、大豆中的雄性不育系，则是细胞核与线粒体不兼容导致的。将细胞器(如叶绿体)和细胞质分离并研究相应的机理，可以为作物改良提供新的思路和方法。

植物细胞质和叶绿体的分离主要分为高质量的原生质体提取和细胞质与叶绿体分离两部分。目前，高等植物的原生质体提取方法比较成熟，但仍然存在一定的问题，例如需要的起始量较大，得到的原生质体易碎等，这对下一步的工作会造成很大的困难。而细胞质与叶绿体分离的技术几乎没有，仅仅有一些叶绿体相关的提取方法，但这些方法通常不会考虑细胞质组分。因此，提供一种将小麦叶片中细胞质和叶绿体分离的技术，不仅为研究小麦起源与进化提供新的角度，更为小麦的种质创新提供了新的技术。

发明内容

本发明的目的是分离小麦的细胞质、叶绿体和原生质体。

本发明首先保护一种分离小麦细胞质和/或叶绿体的方法，可包括如下步骤：

(a1)取切碎的小麦叶片，置于0.3-0.5M甘露醇溶液(如0.3-0.4M甘露醇溶液、0.4-0.5M甘露醇溶液、0.3M甘露醇溶液、0.4M甘露醇溶液、0.5M甘露醇溶液)，黑暗条件下静置5-15min(如5-10min、10-15min、5min、10min或15min)；

(a2)完成步骤(a1)后，过滤，收集沉淀；之后加入酶解液，避光，酶解；

所述酶解液的溶质及其浓度为15-25mM(如15-20mM、20-25mM、15mM、20mM或25mM)MES、0.2-0.6M(如0.2-0.4M、0.4-0.6M、0.2M、0.4M或0.6M)甘露醇、10-30mM(如10-20mM、20-30mM、10mM、20mM或30mM)KCl、1％-2％(如1％-1.5％、1.5％-2％、1％、1.5％或2％)纤维素酶、0.5％-1％(如0.5％-0.75％、0.75％-1％、0.5％、0.75％或1％)离析酶、5-15mM(如5-10mM、10-15mM、5mM、10mM或15mM)CaCl₂、0.1％-0.5％(如0.1％-0.3％、0.3％-0.5％、0.1％、0.3％或0.5％)BSA，3-8mM(如3-5mM、5-8mM、3mM、5mM或8mM)β-巯基乙醇，溶剂为水，pH值自然；

(a3)完成步骤(a2)后，加入W5洗液，26-30℃(如26-28℃、28-30℃、26℃、28℃或30℃)、60-80rpm(如60-70rpm、70-80rpm、60rpm、70rpm或80rpm)避光处理5-15min(如5-10min、10-15min、5min、10min或15min)；