[发明专利]一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法

说明书

本发明公开一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法，包括：步骤一、液体发酵剂的制备；步骤二、三角瓶液体震荡发酵。本发明中发酵所产细菌素具有广泛的抗菌谱，对常见的致病菌如单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，并能抑制包括副伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、痢疾杆菌和大肠杆菌在内的革兰氏阴性菌。本发明采用粗料培养基作为发酵原料，具有工艺简单、酶活性高、单位酶活生产成本低廉等优点，为阿魏酸酯酶的低成本化大规模生产提供依据。

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法。

背景技术

阿魏酯酶(FAEs，E.C.3.1.1.73)是羧酸酯水解酶(E.C.3.1.1.1)的一个亚类，它切断多糖和酚酸之间的酯键。由于它们能够从天然半纤维素和果胶中释放出酚酸，如阿魏酸和对香豆酸。这些酸既与多糖(阿拉伯木聚糖、果胶等)的酯连接，也与植物细胞壁木质素的醚连接，这些形成的网络使植物细胞壁更为坚硬，动物难以利用体内消化酶水解，降低了饲料利用率。FAEs被广泛应用于食品、饲料和制药工业以及燃料生产。该酶不仅具有分解植物的能力，而且有助于合成新型生物活性成分如阿魏酸等，用于食品原料的开发。阿魏酸的大量研究进一步促使科学研究将重点放在探索新型阿魏酯酶上，这种酶在各种工业和医药应用的生物技术过程中具有相当大的作用。目前，阿魏酰酯酶的催化活性较低，生产成本高，限制了其工业应用。因此，有必要提高它们的催化活性并降低成本，以满足日益增长的对阿魏酯酶的需求。

细菌素是核糖体合成的多肽或低分子量的蛋白质，通常能抑制与生产菌株、食源性病原体和腐败细菌密切相关的细菌。其通过与细胞表面受体结合破坏靶细胞。它们的杀菌机制各不相同，可能包括孔的形成，细胞DNA的降解，通过16S rDNA的特定切割而破坏，以及肽聚糖合成的抑制等。细菌素在食品、制药及饲料工业中具有重要意义。细菌素已被报道对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌表现出广泛的活性。细菌素是无色、无嗅、无味、无毒、抗菌活性高、选择性好等优点，其物理特性适合作为饲料添加剂使用，也可能被用作新的治疗药物来补充传统的抗生素。

尽管细菌素和阿魏酸酯酶具有如此重要的用途，但其在生产实践中的应用仍有限，主要原因是多数生产菌株合成细菌素或阿魏酸酯酶的效率低，造成产量不足，成本高，极大地限制细菌阿魏酸酯酶的规模化生产。阿魏酸酯酶生产广泛采用黑曲霉，但黑曲霉发酵产生过氧化氢酶，纤维素酶，淀粉酶等其他多种副产物，大量的杂蛋白对后期的分离纯化工作造成很大的困难，也增加了生产成本。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法，包括步骤：

步骤一、液体发酵剂的制备

a)菌种活化：取甘油冷冻保存的凝结芽孢杆菌菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上初次划线后，30-37℃培养24-48h，从以上培养基上挑取单菌落再次重复在新的牛肉膏蛋白胨培养基上再次划线，同以上相同条件下培养，得到的单菌落备用；

b)一级种子液体培养基培养：从第二次划线培养的培养基上挑取单菌落至种子液体培养基，培养条件为：150mL三角瓶装种子液体培养基10mL-20mL，pH为6.5-7.2，接种一环菌体，32-37℃震荡培养器按照140-210r/min震荡培养12-24h，得到一级种子液；

采用的种子液体培养基：牛肉膏4-10g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-10g、葡萄糖10-20g、NaCl 0.05g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.04，蒸馏水加至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；