[发明专利]一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法

权利要求书

1.一种凝结芽孢杆菌菌株制备细菌素与阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括步骤：

步骤一、液体发酵剂的制备

a)菌种活化：取甘油冷冻保存的凝结芽孢杆菌菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上初次划线后，30-37℃培养24-48h，从以上培养基上挑取单菌落再次重复在新的牛肉膏蛋白胨培养基上再次划线，同以上相同条件下培养，得到的单菌落备用；

b)一级种子液体培养基培养：从第二次划线培养的培养基上挑取单菌落至种子液体培养基，培养条件为：150mL三角瓶装种子液体培养基10mL-20mL，pH为6.5-7.2，接种一环菌体，32-37℃震荡培养器按照140-210r/min震荡培养12-24h，得到一级种子液；

采用的种子液体培养基：牛肉膏4-10g、蛋白胨5-10g、酵母粉5-10g、葡萄糖10-20g、NaCl 0.05g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、MgSO₄·7H₂O 0.04，蒸馏水加至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min；

c)制备二级种子液：按照1-2v/v％的接种量吸取培养好的一级种子液至二级种子培养基中，培养条件为：40-100ml种子培养基装在500mL三角瓶中，在震荡培养器上按照150-210r/min震荡转速32-37℃下震荡培养1-2h，测定OD₆₀₀吸光值达到0.6-0.7，得到二级种子液；

采用的二级种子培养基：花生粕粉5-10g、可溶性淀粉10-20g、葡萄糖5-10g、蛋白胨5-10g、(NH₄)₂SO₄ 1-2 g、MgS0₄·7H₂O 0.01-0.02g、KH₂PO₄ 0.1-0.2g、去离子水定容至l000ml，pH 7.0-7.4，121℃灭菌20min；

步骤二、三角瓶液体震荡发酵

将制备的二级种子液以3-8v/v％的接种量接种到事先装有600-1000mL发酵培养基的3000mL三角瓶中，并使用4-8层纱布封口；发酵过程采取分阶段精密控制工艺，从接种到发酵6h，发酵温度控制在33-35℃，发酵培养基初始pH 6.4-6.8，摇床震荡频率130-160r/min；发酵6-12h，温度控制在34-37℃，摇床震荡频率控制在160-200r/min；发酵至12-36h时，每间隔6h向发酵液中补加浓缩补料培养基，每次补料30-50ml，发酵温度调节至31-34℃，通过补加1mol/L的NaNO₃和NaOH调节发酵液pH在6.8-7.2；发酵至36-48h，发酵温度增加到32-35℃，摇床震荡频率保持不变，pH维持6.8-7.2，发酵至48h，结束发酵；在此发酵条件下，细菌素抑菌活性达到1987U/mL，阿魏酸酯酶酶活力达到378U/L；

发酵培养基配方：花生粕粉5-10g，糖化好的玉米淀粉5-10g，蔗糖5-10g，蛋白胨5-10g，酵母粉5-10g，玉米浆干粉5-10g，尿素1-2g，Tween 80 0.15-0.3g，大量元素10ml，微量元素10mL，麸皮与玉米芯浸提液50-150ml，最后加去离子水定容至1000mL，调节pH 7.0-7.5，121℃灭菌15min；

麸皮与玉米芯浸提液制备方法：将麦麸与玉米芯粉碎，然后加水，并加入盐酸，煮沸0.5小时，过滤取滤液，得到浸提液；

所述大量元素包括：KH₂PO₄ 20-30g/L，(NH₄)₂SO₄ 30-50g/L，KNO₃ 5-20g/L，MgSO₄·7H₂O5-10g/L，CaCl₂·2H₂O 2-4g/L和NaCl 5-10g/L；

所述微量元素包括：MnSO₄·H₂O 0.2-0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 50-80mg/L，CoCl₂·6H₂O100-200mg/L，ZnSO₄·7H₂O 40-80mg/L，CuSO₄·5H₂O 30-50mg/L，H₃BO₃ 10-20mg/L和NaMoO₄·2H₂O 5-10mg/L；

补料培养基：经蛋白酶部分水解后的豆粕粉10-20g、玉米浆干粉10-20g、甘蔗糖蜜10-30g、蚕蛹粉10-20g，去离子水定容至l000ml，121℃灭菌15min。