[发明专利]一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒

说明书

本发明属于蛋白检测领域，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增‑金四面体比色检测方法和试剂盒。包括以下步骤：S1.制备磁珠‑适配体‑互补链复合物；S2.制备DNA‑AuNPs复合物；S3.制备AuNPs四面体；S4.制备滚环扩增模板；S5.肌酸激酶同工酶与互补链的竞争反应；S6.滚环扩增；S7.金四面体聚集显色反应；S8.读数。本发明利用等温扩增技术,不需要复杂的变温过程，稳定性较好，灵敏度较高。相比于其他的检测方法，本发明的比色方法无需大型仪器检测，可以通过imaginJ软件获取检测结果，成本较低，检测限可达0.05pM，适用于现场的筛查与快速检测过程。

技术领域

本发明属于蛋白检测领域，具体地，涉及一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法和试剂盒。

背景技术

过度的体力劳动往往诱发多种疾病。心肌梗死具有高发病率与致死率的特点，受到人们广泛的重视。正常状态下，人体血液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量为1-20ng/ml，但在心肌梗死发生后会立即升高，并在4-6小时内出现异常，含量提高至正常状况的十倍，能够在发病早期被检测到，这使得肌酸激酶同工酶能够作为检测机体异常可靠有效的生物标志物。因此，及时、快速、灵敏地检测CK-MB对预防心肌梗死，保护强体力劳动群体的健康具有重要意义。

多种检测方法被用于定量检测CK-MB。传统的检测方法，如酶联免疫检测法(ELISA)、放射免疫检测法、酶活力法等在临床诊断和治疗过程中常常用于检测CK-MB的水平，但往往需要复杂的样品前处理过程、专业的技术操作人员以及较长的检测时间(5-6小时)，并且往往受限于实验室的环境，无法实现肌酸激酶同工酶的及时快速地检测。此外，抗体虽然能够特异地识别肌酸激酶同工酶，但价格较为昂贵，保存条件较为严格。因此，寻找一种能够实时、实地对肌酸激酶同工酶含量进行快速灵敏检测的方法，是十分重要的。

发明内容

针对现有技术的上述缺点，本发明旨在解决的技术问题是提供一种灵敏可视、简单方便的检测方法，以实现对生物标志物肌酸激酶同工酶含量的及时检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于检测肌酸激酶同工酶的滚环扩增-金四面体比色检测方法，包括以下步骤：

S1.制备磁珠-适配体-互补链复合物：将链霉亲和素化的磁珠与生物素化的适配体相结合，振荡孵育，得到磁珠-适配体复合物；向磁珠-适配体复合物中加入互补链，振荡孵育，得到磁珠-适配体-互补链复合物；

所述适配体的核苷酸序列为5’-GGGGGGTGGGTGGGGGATCTCGGAGGATGCTTTTAGGGGGTTGGG-3’(SEQ ID NO：1)；

所述互补链的核苷酸序列为5’-AACCTAAGCATCTCGAGT-3’(SEQ ID NO：2)；

S2.制备DNA-AuNPs复合物：DNA-AuNPs复合物的制备是由加盐老化法制备的；在单链DNA中加入TCEP溶液，以实现对巯基的活化，然后向该反应体系中加入金纳米粒子，震荡孵育，得到DNA-AuNPs复合物；

所述DNA的核苷酸序列为：(SEQ ID NO：1)；

S3.制备AuNPs四面体：本实验采用两步法制备金四面体；DNA1-4用于合成四面体，先将DNA1-4分别连上Au，然后将修饰了DNA四面体链的AuNPs两两混合，在缓慢降温过程中形成DNA二聚体，之后将二聚体混合，震荡孵育形成DNA四聚体；

所述DNA四面体链分别为：

DNA1:

5’-TTTGCCTGGAGATACATGCACATTACGGCTTTCCCTATTAGAAGGTCTCAGGTGCGCGTTTCGGTAAGTAGACGGGACCAGTTCGCCTTTTTTTTTTTTATTCAGATTCAGGACAGT-3’(SEQ ID NO：3)