[发明专利]一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法

说明书

本发明属于生物分析技术领域，公开了一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇‑乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱检测吡咯喹啉醌的浓度。本发明能够有效测定给予PQQ补充剂后大鼠体内的浓度，具有提取方法简单，检测时间短，线性好，准确度高，精密度好，重现性好等特点。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，涉及一种血浆中吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone,PQQ)的液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

吡咯喹啉醌是细菌脱氢酶氧化还原的辅助因子，被归类为维生素B家族的成员，广泛存在于多种微生物、植物中。人体和哺乳动物自身不能合成，通过饮食补充在体内多个组织中广泛分布。PQQ在哺乳动物中起着重要作用，包括防止肝脏、心脏和脑损伤，增强人成纤维细胞DNA的合成，促进神经生长因子的产生等。此外，它对由氢化可的松诱导造成胚胎性白内障具有防御作用并作为自由基清除剂；它还抑制淀粉样蛋白原纤维的形成并保护由C截短的α-突触核蛋白变体的毒性的特性，使其成为预防帕金森氏病的有效药物。考虑到PQQ具有多种的生理作用，作为补充剂剂量设定，多个药效和毒理实验在给药后，只是从生化指标进行判断是否产生毒性，并未测定体内浓度，因此有必要开发一种测定体内PQQ浓度的简单高效检测方法。

Mizuho Fukuda采用以下方法测定人血浆中PQQ浓度：200μL血浆样品加200μL1MNaH₂PO₄/HCl(pH＝2)酸化血浆，加300μL酸化后血浆到经活化的Varian Bond Elut C18固相萃取柱(依次用4mL甲醇和4mL水活化)，依次用2mL超纯水和600μL5％吡啶水溶液冲洗，最后用600μL 30％乙腈的水溶液洗脱并收集洗脱液，20μL洗脱液进样到液相色谱，从色谱柱洗脱后与0.15mM DTT和1.5mM鲁米诺混合在聚四氟乙烯管氧化还原反应，采用化学发光检测器进行浓度测定。水相为Tris-HNO₃缓冲液(50mM，pH8.8)添加4mM四丁基溴化铵离子对试剂，每个样品分析时间15min。

Takeshi Kumazawa采用以下方法测定人体和大鼠体内血浆和组织中PQQ浓度：在1g或1mL生物样品(血浆、组织)加入4mL 1M HCl、50μL2-巯基乙醇、100μL 10％铁氰化钾、10mL正丁醇混匀后离心取上清；加入20mL正庚烷、1mL吡啶、0.1g NaCl、1mL蒸馏水，充分混匀离心取上清后挥干，用10mL0.1M HCl复溶，加入到Sep-Pak C18 cartridge固相萃取柱中，用20mL 1mM HCl洗脱杂质，再用3mL 5％吡啶水溶液洗脱PQQ，挥干，用100μLPTMA氢氧化物复溶在100℃加热15min使其与PQQ充分甲基化，1μL进样到GC-MS；使用¹³C标记的PQQ作为内标物，测得线性范围在10-250pg，检测线为0.1-1.0ng/g，此种分析方法适合测定通过饮食补充所吸收的体内低PQQ浓度。

以上对于PQQ血浆样品提取方法包括固相萃取、衍生化、多次液液萃取，存在操作麻烦，耗时长，有机溶剂消耗较多，成本高、检测器不常用、分析时间长等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过前处理简单有效的提取血浆中的PQQ，再在较短的测定时间内准确的检测血浆样品中的PQQ。

本发明的技术方案如下：

一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测吡咯喹啉醌的浓度。