[发明专利]一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用，其中促进鸭T细胞增殖的方法包含以下步骤：H5N1HPAIV体内接种鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；将H5N1HPAIV体外感染鸭记忆性PBMC与未感染的记忆性PBMC混合培养。本发明利用H5N1HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。建立了一种促进鸭T细胞增殖的制备方法，为研究鸭T细胞对H5N1HPAIV免疫应答机制提供材料。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种促进鸭T细胞增殖的方法及其应用。

背景技术

甲型流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，病毒的核酸结构为分节段的单股负链RNA，主要通过呼吸道和粪口途径传播，在流感爆发期，H5N1亚型高致病性禽流感病毒(H5N1HPAIV)可通过水禽接触到人或者其他的哺乳动物(Tian et al.,2015)，H5N1 HPAIV自从1997年被首次发现以来，人感染后死亡的病例已高达50％以上，在跨种传播的同时给养殖业带来严重的经济损失，对人和动物的健康造成极大的威胁(Evseev et al.,2019；EntersFor Disease C,1997)。目前对H5N1 HPAIV研究主要集中于天然免疫，而在适应性免疫方面研究较少，研究鸭记忆性T细胞功能对流感疫苗评估和新型药物的制备必不可少。目前T细胞研究主要集中于哺乳动物，而没有报道鸭T细胞增殖方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种鸭T细胞的制备方法。

一种鸭T细胞的制备方法，包含以下步骤：

S1：H5N1 HPAIV接种麻鸭后由外周血分离得到鸭记忆性PBMC；

S2：H5N1 HPAIV体外感染步骤S1中的鸭记忆性PBMC，与未感染的记忆性PBMC混合培养。

其中感染鸭记忆性PBMC作为APC(抗原递呈细胞)递呈病毒抗原多肽，未感染的记忆性PBMC作为受体细胞接受刺激产生应答。

在本发明的一些实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV体内接种麻鸭后25～30天由外周血分离得到。

在本发明的一些优选实施方式中，所述鸭记忆性PBMC为H5N1 HPAIV感染麻鸭后28天由外周血分离得到。

在本发明的一些实施方式中，所述H5N1 HPAIV接种麻鸭具体为采用点眼滴鼻的方法，每只鸭接种10⁶EID₅₀/200μL。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中以MOI＝2～5感染细胞。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中以MOI＝5感染细胞。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中于感染6～12h后收集细胞。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤S2中于感染6h后收集细胞。

本发明还提供一种鸭T细胞，由上述方法制备。

本发明还提供上述鸭T细胞在制备疫苗或药物中的应用。

本发明的有益效果：本发明建立了一种鸭T细胞的制备方法，利用H5N1 HPAIV刺激CFSE标记的鸭记忆性PBMC(外周血单个核细胞)，从T细胞形态、数量和CFSE标记变化三个方面检测T细胞的增殖，确立了最佳接种时间点与最佳MOI，同时利用qPCR检测T细胞增殖后细胞因子表达变化情况。为研究鸭T细胞对H5N1 HPAIV免疫应答机制提供材料。

附图说明

图1为H5N1 HPAIV感染后不同时间细胞活率。