[发明专利]一种LPS感染后检测并调控鸡RIPK2基因甲基化的方法

说明书

本发明涉及一种LPS感染后检测并调控鸡RIPK2基因甲基化的方法，包括以下步骤：步骤1）、LPS感染鸡巨噬细胞HD11，检测RIPK2基因表达量变化；步骤2）、重亚硫酸氢盐处理LPS感染前后的基因组；步骤3）、鸡RIPK2基因启动子区CpG岛片段PCR扩增和测序分析；步骤4）、5‑氮杂胞苷和M.SssI分别处理转染鸡RIPK2启动子质粒的鸡HD11细胞；步骤5）、5‑氮杂胞苷和M.SssI分别处理鸡HD11细胞，检测RIPK2基因表达量；通过本发明，对缓解应激性病理损伤和提高家禽健康具有重要的实践意义。

技术领域

本发明涉及一种LPS感染后检测并调控鸡RIPK2基因甲基化的方法，属于基因工程领域。

背景技术

RIPK2是RIPK激酶家族的一个成员，主要通过NOD/RIPK2通路进行免疫炎症调节。抑制 RIPK2 基因可减少各种炎症因子的释放和缓解炎症反应综合征。而高表达RIPK2 时可激活 p38 MAPK通路，能更有效的清除大肠杆菌。这表明RIPK2对胞内菌的识别、炎症反应的缓解以及其NOD/RIPK2通路对宿主免疫的调节都发挥着关键作用。因此，调控基因RIPK2的表达对机体免疫炎症的调节具有重要实践意义。

基因表达是一个受时间和空间等多因素调控的复杂过程。表观遗传修饰是影响基因表达的一个重要因素。DNA甲基化作为一种常见的表观遗传修饰方式，可在DNA甲基转移酶的催化作用下，使CpG二核苷酸5'-胞嘧啶变为5'-甲基胞嘧啶。DNA 甲基化能引起染色质结构、DNA 构象、DNA 稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达，是基因转录前表达调控的重要方式。启动子DNA甲基化可通过阻碍转录因子与识别序列结合、结合甲基化CpG结合蛋白并募集辅阻遏复合物而形成转录抑制复合物等方式抑制基因的转录。目前对鸡RIPK2基因表达的表观遗传调控机制尚不清楚。

因此，如何实时调制鸡RIPK2基因的表达水平，提高机体免疫反应并降低过度炎症反应是实践应用中的重中之重。目前，新发展的焦磷酸测序技术BSP可单次快速、准确定量多个甲基化位点，在哺乳动物中应用较多，但在家禽中鲜少研究。且5-氮杂胞苷和CpG甲基转移酶M. SssI已广泛应用在人类癌症临床治疗上，具有一定的安全性。故本研究通过BSP法检测LPS感染前后鸡RIPK2基因启动子区甲基化变化；并利用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷和CpG甲基转移酶M. SssI（过甲基化）分别处理鸡HD11细胞，检测鸡RIPK2启动子活性及基因表达水平，对提高家禽免疫和控制过度性炎症反应具有非常重要的现实意义。

发明内容

为了解决家禽生产中控制免疫和过度炎症反应的问题，发明人进行了大量研究，从筛选出的抗禽致病性大肠杆菌鸡中发现RIPK2及其通路发挥着重要作用，且敲除、过表达鸡RIPK2对免疫和炎症反应具有正向调控作用，提供一种LPS感染后检测并调控鸡RIPK2基因甲基化的方法，本发明进一步探究鸡RIPK2基因的表达调控的因素，对缓解应激性病理损伤和提高家禽健康具有重要的实践意义。

本发明的目的是这样实现的，一种LPS感染后检测并调控鸡RIPK2基因甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）、LPS感染鸡巨噬细胞HD11，检测RIPK2基因表达量变化；

登录NCBI数据库下载鸡RIPK2基因mRNA序列，鸡RIPK2基因ID为NM_001030943.1；采用Primer premier 5.0软件设计引物序列；鸡巨噬细胞HD11复苏后添加至含10%的胎牛血清DMEM培养基，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，次日观察细胞生长情况传代培养；10 μg/mL LPS感染细胞48 h后，利用qRT-PCR检测鸡RIPK2表达量；

步骤2）、重亚硫酸氢盐处理LPS感染前后的基因组；

利用基因组DNA试剂盒提取鸡巨噬细胞HD11基因组，核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度，利用Methylation-Gold Kit试剂盒进行重亚硫酸氢盐DNA甲基化；

步骤3）、鸡RIPK2基因启动子区CpG岛片段PCR扩增和测序分析；