[发明专利]一种守宫粉提取物的抗病毒用途及其提取方法

权利要求书

1.一种守宫粉提取物的抗病毒用途，抗病毒用途包括以下操作步骤，其特征在于，所述操作步骤如下：

S1：选择实验动物、细胞、病毒和提纯后的守宫粉提取物；

S2：细胞毒性测定；

S3：抗病毒测定；

S4：免疫荧光分析；

S5：qRT-PCR；

S6：蛋白质印迹；

S7：守宫粉提取物对RABV感染小鼠的治疗；

S8：得出结论，守宫粉提取物的细胞毒性、守宫粉提取物的体外抗病毒作用和守宫粉提取物在体内的抗病毒作用。

2.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S1中，实验动物选用SPF级昆明小鼠、雌性、18-22g，需在实验室中进行3天的适应期；

细胞选用BHK-21细胞，在含有5％胎牛血清的培养基中培养；

病毒选用RABV株CVS-11，在BHK-21细胞中繁殖，储存在-80℃，病毒滴度确定为50％组织培养物感染剂量(TCID50)/ml。

3.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S2中，细胞毒性测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，在37℃下孵育24h，用含各浓度守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)的新鲜培养基替换培养基并孵育48h，用MTS分析评估存活的细胞级分，通过剂量-反应曲线的非线性回归分析确定最大半数细胞毒性浓度(CC50)。

4.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S3中，抗病毒测定需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，并如上所述进行孵育，然后在37℃下用CVS-11(感染复数[MOI]＝0.1)感染1h，PBS洗涤后，新鲜培养基中应含不同浓度的守宫粉提取物(0.69、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88和43.75mg)或IPS(0.125、0.25、0.5、1、2、5和10mM)，孵育48h；

计算公式为：TCID50评估抗病毒作用：抑制率(％)＝[(对照组病毒滴度-治疗组病毒滴度)/(对照组病毒滴度)]×100％，通过剂量-反应曲线的回归分析计算出50％抑制浓度(IC50)，结果表示为选择性指数(SI＝CC50/IC50)。

5.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S4中，免疫荧光分析需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在96孔板中，24h后将细胞用MOS＝0.1的CVS-11感染，在37℃下孵育1h，PBS洗涤后，添加不同浓度的守宫粉提取物(0、2.74和5.47mg)或IPS(0、0.5和1mM)，在37℃、5％CO2下培养48h，弃培养基，加入50uL/孔80％冷丙酮，然后放入-20℃固定1h，弃固定液，PBS洗涤3次，37℃下与50uL/孔FITC-狂犬病病毒免疫球蛋白，孵育1h，弃抗体，PBST洗涤3次，加入50uL/孔90％甘油缓冲液，荧光显微镜下观察荧光信号并拍照。

6.根据权利要求1所述的一种守宫粉提取物的抗病毒用途，其特征在于，所述S5中，qRT-PCR需将BHK-21细胞以2×105/ml的密度接种在12孔板中，并用CVS-11感染，用含有不同浓度守宫粉提取物的新鲜培养基代替培养基，孵育48h，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，Mx3000P Q-PCR系统进行qRT-PCR；

所用的引物列于下表中，热循环条件如下：95℃变性30s，95℃下5s和60℃下40个循环1min，靶基因的相对定量采用2-ΔΔCt方法进行，每个反应一式三份，实验重复至少3次。

用于qRT-PCR的靶基因引物的序列和大小