[发明专利]一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于：包括分别针对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、埃博拉病毒以及新型冠状病毒及其变异株的七组特异性引物和野生型封闭探针；

针对甲型流感病毒，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ ID No.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；野生型封闭探针1的序列如SEQ ID No.3；

针对乙型流感病毒，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ ID No.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；野生型封闭探针2的序列如SEQ ID No.6；

针对呼吸道合胞体病毒，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；野生型封闭探针3的序列如SEQ ID No.9；

针对重症急性呼吸综合征，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ IDNo.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；野生型封闭探针4的序列如SEQ ID No.12；

针对中东呼吸综合征，特异性引物对包括引物9和引物10，引物9的序列如SEQ IDNo.13，引物10的序列如SEQ ID No.14；野生型封闭探针5的序列如SEQ ID No.15；

针对埃博拉病毒，特异性引物对包括引物11和引物12，引物11的序列如SEQ ID No.16，引物12的序列如SEQ ID No.17；野生型封闭探针6的序列如SEQ ID No.18；

针对新型冠状病毒，特异性引物对包括引物13和引物14，引物13的序列如SEQ IDNo.19，引物14的序列如SEQ ID No.20；野生型封闭探针7的序列如SEQ ID No.21；

针对新型冠状病毒变异株，特异性引物对包括引物15和引物16，引物15的序列如SEQID No.22，引物16的序列如SEQ ID No.23；野生型封闭探针8的序列如SEQ ID No.24。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于：所述野生型封闭探针进行标记的荧光基团包括但不限于：FAM、HEX、VIC、ROX、TAMRA、CY5中的一种；其淬灭荧光基团的标记包括但不限于：TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB、DABCYL、BHQ3中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于：所述野生型封闭探针的修饰包括硫代修饰、脱氧脲嘧啶、脱氧次黄嘌呤、2-甲氧基修饰中的一种或多种，其中野生型封闭探针中Linker序列为与原序列不匹配的2-6个任意碱基序列。

4.一种同步检测多项呼吸道病原体的检测方法，利用权利要求1-3中任一项所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测试剂盒，其特征在于：具体包括以下步骤:

步骤一、核酸样本的提取：采集样本并提取DNA，将提取的DNA转移至冰箱保存备用；

步骤二、荧光定量PCR反应：

(1)配制20μL PCR扩增体系，包括：mix 10μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4μL、野生型封闭探针0.2μL、水7μL和模板2.0μL；

(2)将上述配置的PCR扩增体系与步骤一提取得到的DNA匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件：95℃5min预变性；然后依次在95℃10S,60℃30S,进行40个循环；熔解曲线程序为：95℃for 1min,40℃for 30s then with a 1％ramp to 95℃；

步骤三、PCR结果分析：根据步骤二中获得的扩增曲线对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞体病毒、重症急性呼吸综合征、中东呼吸综合征、埃博拉病毒以及新型冠状病毒及其变异株的检测结果进行检测和判读，判断样本中是否含有待检测的病原感染。

5.根据权利要求4所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测方法，其特征在于：步骤二所述PCR扩增体系中还包括热稳定且具备或者不具备5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。

6.根据权利要求4所述的一种同步检测多项呼吸道病原体的检测方法，其特征在于：步骤二所述PCR扩增体系中至少设置有一个双标记寡核苷酸野生型封闭探针的Tm值大于与之匹配的两个引物的Tm值，且对应相同靶序列的双标记寡核苷酸野生型封闭探针的实时扩增荧光信号能被正常检测。