[发明专利]一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法

说明书

本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学技术领域，尤其涉及一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法，包括以下步骤：步骤一、获取甘蔗属着丝粒特异重复序列；步骤二、分离甘蔗属着丝粒重复序列并开展计数分析；本发明利用甘蔗属着丝粒特异组蛋白的染色质免疫共沉淀与高通量测序技术相结合(ChIP‑Seq)的方法得到了甘蔗着丝粒区DNA序列；通过比较分析，筛选出在不同甘蔗种着丝粒区具有的重复序列；根据该序列设计引物，扩增、标记后用于有丝分裂中期荧光原位杂交(FISH)，进行染色体计数。结果显示，这一序列在不同甘蔗种的全部染色体的着丝粒区域产生特异且清晰明亮的信号；通过统计着丝粒信号数目可快速、准确获得不同材料染色体数目。

技术领域

本发明涉及生物信息学与分子细胞遗传学技术领域，尤其涉及一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum spp.)是我国乃至世界上重要的糖料作物和生物能源作物。目前普遍认同将甘蔗属主要分为六个种：两个野生种分别是割手密种和大茎野生种，四个栽培种即热带种、中国种、印度种和肉质花穗种。研究证实，甘蔗属物种均为多倍体，具有数目众多的染色体且变异大。其中，割手密种现已发现的材料染色体数目从40到128条不等，大约40种基因型，是蔗属中变异最大的一个种；大茎野生种染色体数目为2n＝60或80；热带种，又名高贵蔗，染色体数目为2n＝80；中国种、印度种及肉质花穗种的染色体数目在60-120之间。现代甘蔗栽培种来源于热带种和割手密种的杂交及不同世代的回交，由于杂交及回交过程出现的2n+n现象，导致选育的栽培种染色体组成十分复杂，染色体数目往往100条。

着丝粒是真核生物染色体上必不可少的结构元件。在细胞分裂过程中负责招募动粒蛋白，并在纺锤丝牵引下保障染色体的准确分离，是遗传物质后稳定传递的重要保障。着丝粒区的一个重要特种是具有一种特异组蛋白H3，即CENH3。据此，可通过制备相应着丝粒组蛋白CENH3抗体，并采用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitationassay,ChIP)分离生物体内与着丝粒特异组蛋白CENH3相互作用的DNA，即着丝粒DNA。因此，这一方法也成为功能着丝粒序列发掘的有效手段。该方法与第二代高通量测序技术相结合(ChIP-Seq)可以在全基因组水平高效地分离着丝粒DNA序列，目前已被广泛应用于着丝粒的研究中。真核生物着丝粒DNA主要由重复序列组成，并且，着丝粒重复序列往往表现出高度变异性。近期研究表明，不同物种、乃至亲缘关系较近的种间着丝粒重复序列亦可能有很大不同，因此，往往难以获得不同种间共有着丝粒序列。

获得染色体的准确数目是开展遗传研究的前提和基础。甘蔗属个各种，特别是现代栽培种庞大数量且高度变异的染色体数目严重阻碍了甘蔗属的遗传研究和育种利用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法，利用CENH3抗体进行ChIP-Seq实验，分离获得了着丝粒序列重复序列，经过比较分析，获得在不同甘蔗种着丝粒特有的重复序列，该序列标记后可在FISH实验中产生明亮着丝粒信号，通过统计信号数量可简便准确进行染色体计数。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种应用甘蔗着丝粒特异重复序列开展染色体准确计数的新方法，包括以下步骤：

步骤一、获取甘蔗属着丝粒特异重复序列：采用着丝粒ChIP-seq分析甘蔗属内不同甘蔗种，获各个甘蔗种共有着丝粒重复序列，其序列特异存在于各个甘蔗种的着丝粒区，序列名称为CENTS，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：